利用正交設計優化番茄SRAP-PCR反應體系

郭彩杰 侯麗霞 崔 娜 韓明利

（1山東省農業科學院蔬菜研究所，山東省設施蔬菜生物學重點實驗室，國家蔬菜改良中心山東分中心，山東濟南 250100；2沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽 110161）

利用正交設計優化番茄SRAP-PCR反應體系

郭彩杰1，2侯麗霞1*崔 娜2*韓明利2

（1山東省農業科學院蔬菜研究所，山東省設施蔬菜生物學重點實驗室，國家蔬菜改良中心山東分中心，山東濟南 250100；2沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽 110161）

以番茄耐低溫材料抗寒0號和不耐低溫番青的 F2為材料，利用正交試驗設計對 SRAP-PCR反應體系中的5因素（模板DNA、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶）在4個水平上進行正交優化試驗。結果表明:各因素水平變化對反應體系影響的大小依次為:引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。建立番茄耐低溫SRAP-PCR的20 μL最佳反應體系為:模板DNA為15 ng、引物濃度0.75 μmol·L-1、Mg2+濃度2.0 mmol·L-1、dNTPs濃度0.125 mmol·L-1、Taq DNA 聚合酶1.0 U。

番茄；正交設計；優化；SRAP

相關序列擴增多態性（squence-related amplified polymorphism，SRAP）是由美國加州大學蔬菜作物系Li和Quirost（2001）提出的一種基于PCR技術的新的DNA分子標記技術。SRAP具有簡單、高效、高共顯性、重復性好、易測序等優點，尤其可以檢測基因的可譯讀碼框（ORFs）區域，從而提高了擴增結果與表現型的相關性。目前SRAP標記已開始在植物種質資源鑒定評價、種緣進化關系、遺傳圖譜構建、基因定位、重要性狀標記以及比較基因組學方面得到成功應用。

番茄（Lycopersion esculentumMill.）是一種喜溫蔬菜，最適宜的生長溫度是15～30 ℃。低溫嚴重影響番茄的品質和產量。番茄的耐低溫性是由多個基因控制的非常復雜的數量性狀，也受環境因素的影響（Kharti et al.，1994）。近年來，對于番茄抗冷性狀的選擇正由傳統的表型選擇向DNA分子水平的基因直接選擇發展。本試驗采用正交試驗設計的方法，建立番茄耐低溫SRAPPCR的最優反應體系，為番茄耐低溫分子標記及分子育種提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

據2007年露地栽培耐低溫試驗，抗寒0號和番青同時播種、定植，抗寒0號生長正常，番青全部死亡；據低溫發芽試驗，抗寒0號發芽正常，番青不發芽，表明抗寒0號耐低溫，番青不耐低溫。抗寒0號（♀）與番青（♂）由山東省農業科學院蔬菜研究所自主選育，將二者的F2于2009年9月播種在山東省農業科學院蔬菜研究所試驗基地日光溫室中，幼苗生長4～5片葉時取樣，提取葉片基因組DNA。Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。P1:5′TGAGTCCAAACCGGATA3′和P2:5′GACTGCGT ACGAA TTTGC3′為本試驗正交試驗設計方案中的固定引物。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 快捷型植物基因組DNA提取系統購自天根生化科技（北京）有限公司，紫外分光光度計及1.5 %瓊脂糖凝膠檢測其純度和濃度，并稀釋到15 ng·L-1備用。

1.2.2 正交試驗設計方案 采用正交設計L16（45）進行試驗，設計模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶等5因素4水平（表1），3次重復。PCR反應體系20 μL，程序為:95 ℃5 min，94 ℃1 min，35 ℃1 min，72 ℃1 min，5個循環；94 ℃1 min，50 ℃1 min，72 ℃1 min，40個循環，72 ℃10 min，-4 ℃保存。產物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照，Bandscan軟件分析圖像，根據條帶數目和背景依次給16個反應打分，條帶最多的記為16，最少的記為1，3次重復分別計分（謝云海 等，2005）（表2），將得分的平均值輸入DPS V7.05軟件進行統計分析，分別得出5因素對PCR試驗影響大小的值。

1.2.3 SRAP-PCR優化體系的驗證 采用SRAP-PCR已優化的反應體系，用14對引物（表4）對耐低溫材料抗寒0號、不耐低溫材料番青DNA進行擴增，以驗證該體系的效果。

2 結果與分析

表1 PCR體系的因素水平

2.1 電泳結果評分

按照表2設計的16個反應進行PCR試驗，電泳的檢測結果如圖1所示，得分如表2所示，取3次重復得分平均值在假設不存在交互作用下進行直觀分析。求各列各水平得分平均值的和（T1、T2、T3和 T4），各水平的平均值（、、和），用各列最大平均值減去最小平均值得極差R（表3），極差越大說明該因素對反應結果影響越大。分析極差R可知，引物對反應結果影響最大，Mg2+對反應結果影響最小，各因素對反應結果的影響大小依次:引物＞TaqDNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。

表2 PCR正交試驗設計表L16（45）

2.2 各因素對PCR結果的影響

2.2.1 引物濃度對PCR結果的影響 PCR反應中引物濃度影響PCR擴增特異性效果（表3），PCR引物濃度在0.25 μmol·L-1和0.50 μmol·L-1時對PCR結果的影響差異不大，PCR反應得分平均值均較低（、），0.75 μmol·L-1水平與各水平差異較大。表明0.75 μmol·L-1為體系引物濃度的最佳條件。

表3 PCR正交試驗得分統計分析結果

表4 SRAP引物組合序列

2.2.2TaqDNA聚合酶對PCR結果的影響TaqDNA聚合酶量是影響PCR反應的一個重要因素（表3）。本試驗體系中TaqDNA聚合酶量為0.5 U時，PCR反應得分平均值偏低；TaqDNA聚合酶量為1.0 U和2.0 U時，PCR反應得分平均值（和）相差不大。TaqDNA聚合酶價格較高，在確保穩定的情況下，選擇TaqDNA聚合酶量1.0 U為最佳反應條件。

2.2.3 dNTPs對PCR結果的影響 dNTPs是PCR的反應原料，一般濃度范圍為0.05～0.20 mmol·L-1。本試驗中隨著dNTPs濃度的增高，PCR反應得分平均值呈下降趨勢，dNTPs最佳濃度為0.125 mmol·L-1（表3）。

圖1 PCR產物電泳圖

2.2.4 模板DNA對PCR結果的影響 模板DNA的用量和純度對PCR的結果有著重要的作用，它對產物的產量和特異性都有影響。本試驗中，隨著模板DNA濃度的升高，PCR反應得分平均值呈下降趨勢（表3）。在保證擴增條帶清楚的條件下，應盡量減少模板DNA的用量。所以本試驗中模板DNA用量15 ng應為最佳反應量。

2.2.5 Mg2+濃度對PCR結果的影響 Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產量有明顯的影響。隨著Mg2+濃度增大，PCR反應得分平均值逐漸升高，當Mg2+濃度超過2.5 mmol·L-1時，得分平均值開始下降，Mg2+濃度在2.0、2.5 mmol·L-1時，PCR反應得分平均值相差不大（表3），從節約的角度選擇2.0 mmol·L-1Mg2+作為體系的最佳濃度。

2.3 SRAP-PCR優化反應體系的驗證結果

采用SRAP-PCR已優化的20 μL反應體系（模板DNA為15 ng、引物濃度0.75 μmol·L-1、Mg2+濃度2.0 mmol·L-1、dNTPs濃度0.125 mmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0 U），以14對引物對番茄不耐低溫、耐低溫材料用2.0 mmol·L-1的DNA進行擴增，以驗證該體系的效果。從圖2中可以看出，利用SRAP-PCR優化體系進行 PCR擴增，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行檢測，結果條帶清晰、多態性較豐富。

圖2 SRAP-PCR產物電泳驗證圖

3 結論與討論

劉立軍等（2006）認為不同植物的SRAP-PCR反應體系是不同的，建立一個特定試驗條件下適合該植物的最佳SRAP-PCR反應體系可為SRAP分子標記提供良好的基礎。本試驗獲得的番茄耐低溫SRAP-PCR反應體系中，20 μL的最佳反應體系:模板DNA15 ng、引物濃度0.75 μmol·L-1、Mg2+濃度2.0 mmol·L-1、dNTPs濃度0.125 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U。此最佳體系與正交設計表中得分最高的編號為5和16的反應大部分相似。王燕等（2007）對番茄基因組DNA的SRAPPCR反應體系進行優化，得到的最佳反應體系為:Mg2+濃度為1.5～3.0 mmol·L-1，模板DNA為10～20 ng（每10 μL體系）、引物濃度為0.25 μmol·L-1、dNTPs濃度為0.05～0.20 mmol·L-1。李曉慧等（2008）對西瓜SRAP-PCR反應體系的優化結果為:20 μL體系中，模板DNA為100 ng、引物濃度60 ng、Mg2+濃度2.0 mmol·L-1、dNTPs濃度0.3 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U。本試驗通過正交試驗設計確立了番茄耐低溫的SRAP-PCR反應體系中各因素的最佳具體濃度，同西瓜SRAPPCR反應體系相比有一定的差異，表明不同植物間的SRAP-PCR反應體系存在明顯差異；同王燕等（2007）對番茄基因組DNA的SRAP-PCR反應體系相比有細微的差異，表明同一作物在不同品種間也會存在不同。番茄耐低溫的SRAP-PCR反應體系的確立是在標準SRAP-PCR的基礎上增加5個循環，在瓊脂糖凝膠電泳上進行的，最佳反應體系存在豐富的擴增條帶，此方法簡單快捷，為SRAP分子標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳提供了依據，利用本優化體系進行PCR擴增，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行檢測，結果是條帶清晰、多態性較豐富。此方法也為番茄耐低溫育種提供了重要的輔助方法。

謝云海，夏德安，姜靜，林萍.2005.利用正交設計優化水曲柳ISSR-PCR反應體系.分子植物育種，3（3）:445-450.

王燕，龔義勤，趙統敏，劉廣，郁樊敏，葉海龍，柳李旺.2007.番茄SRAP-PCR體系優化與品種分子鑒定.南京農業大學學報，30（1）:23-29.

李曉慧，王從彥，徐小利，常高正，張四普.2008.西瓜SRAP-PCR反應程序的建立與體系優化.華北農學報，23（3）:38-41.

劉立軍，蒙祖慶，邢秀龍，彭定祥.2006 .苧麻基因組SRAP擴增體系的優化研究.分子植物育種，4（5）:726-730.

Li G，Quiros C F.2001.Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica.Theor and Appl Genet，103（2）:455-461.

Kharti V G，Polesskaya L M，Zhakoteh A G.1994.Comparative evaluation of genetic organization of quantitative cold-resistance traits of tomato（Lycopersicon esculentum L. hirsutum）during germination and the early vegetative stage.Genetika，30（4）:502-508.

Optimization of SRAP-PCR System for Tomato Based on Orthogonal Design

GUO Cai-jie1,2, HOU Li-xia1*, CUI Na2*, HAN Ming-li2
（1Institute of Vegetables, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Key Lab for Biology of Greenhouse Vegetable of Shandong Province, National Center for Vegetable Improvement（Shandong）, Jinan250100, Shandong, China;2Biological Science and Technology College, Shenyang Agricultural University, Shenyang110161, Liaoning, China）

The orthogonal design was used to optimize SRAP-PCR amplification system at4 levels of5 factors in tomato（Lycopersion esculentum Mill.）（DNA template, primer, Mg2+, dNTPs and Taq DNA polymerase）. The results showed that the order of each factor in different levels affected the result of PCR was: primer＞Taq DNA polymerase＞dNTPs＞DNA template＞Mg2+. The most suitable SRAP-PCR reaction system for tomato was total20 μL containing15 ng DNA template,0.75 μmol·L-1primer,2.0 mmol·L-1Mg2+,0.125 mmol·L-1dNTPs and1.0 U Taq DNA polymerase.

Tomato; Orthogonal design; Optimization; SRAP

S641.2

A

1000-6346（2011）02-0048-05

2010-09-06；接受日期:2010-10-20

國家“863”計劃項目（2006AA100108-3-1），遼寧省教育廳科學技術研究項目（2008623）

郭彩杰，女，碩士研究生，主要從事植物發育分子生物學的研究，E-mail:guocaijie@163.com

*通訊作者（Corresponding authors）:侯麗霞，博士，副研究員，主要從事番茄育種與分子生物學研究，E-mail:houlx2006@126.com

崔娜，博士，副教授，碩士生導師，主要從事植物發育分子生物學研究，E-mail:syaua@163.com