結球甘藍西園4號種子純度的SSR鑒定

苗明軍 李成瓊 司 軍 任雪松 宋洪元

（1西南大學園藝園林學院，重慶市蔬菜學重點實驗室，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶 400715；2四川省農業科學院園藝研究所，四川成都 610066）

結球甘藍西園4號種子純度的SSR鑒定

苗明軍1，2李成瓊1*司 軍1任雪松1宋洪元1

（1西南大學園藝園林學院，重慶市蔬菜學重點實驗室，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶 400715；2四川省農業科學院園藝研究所，四川成都 610066）

利用SSR分子標記技術對結球甘藍西園4號及其親本的DNA進行擴增，從90對SSR引物中篩選出1對具有雙親條帶差異明顯的引物O112-G04，構建了清晰的DNA擴增指紋圖譜，并對西園4號種子進行了純度鑒定，與田間形態學的鑒定結果高度一致，種子純度均為96.7 %。結果表明，利用這對引物對結球甘藍西園4號種子的純度鑒定是可行的。

結球甘藍；SSR標記；純度鑒定

結球甘藍（Brassica oleracea L. var. capitata L.）是我國重要的蔬菜作物之一。西園4號是利用自交不親和系配制的秋甘藍一代雜種，在西南地區栽培面積較大。由于制種過程中管理措施不當和自交不親和性本身的缺陷常會產生自交種子，即假雜種。純度不高的種子會對生產造成很大損失，因此，對甘藍種子進行純度鑒定是非常必要的。形態學鑒定受周期長、成本高、環境條件等因素制約。

分子標記技術的快速發展為種子的純度鑒定提供了一種更為快速、高效的方法（方宣鈞 等，2000；Yashitola et al.，2002）。SSR分子標記信息含量高，重復性好，廣泛、隨機、均勻地分布于整個基因組，呈共顯性遺傳，利用雜交種雙親在一些SSR標記位點的差異，可以將具有父母本互補帶型的雜交種與其雙親、甚至一些異源花粉造成的雜交種區分開（李召華 等，2006）。目前，RAPD標記（莊木 等，1999）和 AFLP標記（田雷 等，2001）在甘藍種子純度鑒定方面已有應用，SSR標記在甘藍種子純度鑒定中鮮見報道，本試驗利用SSR標記技術構建西園4號及親本DNA指紋圖譜，篩選出共顯性引物，建立快速、穩定的SSR分子標記種子純度檢測技術體系，并與田間形態學鑒定結果進行比較，為甘藍雜交種純度鑒定提供理論基礎。

1 材料與方法

雜交種:西園4號，小區隔離制種，親本:母本E1，父本C1，均由西南大學十字花科蔬菜研究所提供。2009年7月在西南大學十字花科蔬菜研究所實驗基地播種，SSR標記鑒定在西南大學重點實驗室進行。DNA提取采用CTAB方法（王掌軍和馬駿，2008），并加以改良。甘藍幼苗長出3～4真葉時，采用改良后的CTAB方法提取基因組DNA。

本試驗按照http://www.uk.crop.net網站上公布的序列合成了90對甘藍類蔬菜SSR引物，由上海生工生物工程服務有限公司合成。SSR擴增反應體系（司軍 等，2009）為10 μL，1×Buffer（含20.00 mmol·L-1MgCl2），50.00 μmol·L-1dNTPs，模板 DNA（50 ng·μL-1），0.4 UTaqDNA聚合酶（2 U·μL-1），0.4 μmol·L-1SSR引物，1.00 μL DNA，加ddH2O至終體積10 μL。擴增反應在Mastercycle gradient梯度PCR儀上進行，94 ℃預變性5 min后進行20個迫降循環，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，每個循環降低0.5 ℃；再進行15個循環，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。擴增產物采用8 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，采用銀染顯色，觀察并照相記錄。

田間父母本各種植40株，各分兩個小區，西園4號種植60株，分3個小區。西園4號單株掛牌編號，分別在苗期、結球期進行形態學調查。

2 結果與分析

2.1 田間種子純度鑒定

田間調查結果發現，父母本分別在苗期和結球期各調查40株，異形株率為0。雜交種西園4號在苗期調查60株，異形株率為0；結球期調查發現有2株為異形株，異形株率為3.33 %，雜交種西園4號的純度為96.7 %。異形株的編號分別為8號植株和25號植株。8號植株與母本性狀一樣，葉柄短、蠟質厚、縱橫徑較小、葉球偏小、內縮短徑短。25號植株與父本表型性狀一樣，葉色灰綠、蠟質厚、縱橫徑大、葉球偏大、內縮短徑長。

2.2 SSR標記種子純度鑒定

2.2.1 DNA提取與檢測 利用改良CTAB方法提取的 DNA經0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測和采用超微量核酸蛋白測定儀測定樣品濃度，OD值均在1.8～2.0之間，瓊脂糖電泳條帶清晰，無拖尾現象（圖1）。說明所提取的 DNA純度高、質量好。

2.2.2 特征型引物的篩選 引物的篩選是SSR標記進行雜交種純度鑒定的一個關鍵的技術前提。本試驗利用SSR標記技術在90對引物中篩選出22對多態性引物，共擴增出92條清晰、可重復性條帶，每對引物擴增條帶數為2～6條。其中69條為具有多態性的條帶，多態性百分率為75 %。平均多態性條帶為3.14條。最后篩選出1對具有共顯性的引物O112-G04，即能在親本C1和E1之間擴增出互補的特異譜帶，譜帶間大小差異明顯，很容易將雜交種與其親本分辨開，多次重復，結果穩定。這對引物可用于西園4號種子純度鑒定。引物序列為:（正）CGAACATCTTAGGCCGAATC（反）GGTTAAC CTGCGGGATATTG特征引物篩選如圖2。

圖1 部分甘藍樣品基因組DNA的檢測結果

2.2.3 純度鑒定 利用篩選出的 SSR引物O112-G04對60個西園4號單株及其父母本進行SSR標記純度鑒定，從圖3中可以看出，8、25號植株屬于非真實雜交種，8號植株缺少父本特異條帶，與母本擴增圖譜一樣，說明8號植株為母本苗，25號植株缺少母本特異條帶，與父本擴增帶型相同，說明它是父本苗。西園4號雜交種純度為96.7 %。田間形態學鑒定結果與SSR標記雜交種純度檢測結果一致，說明利用SSR標記進行種子純度鑒定可以準確反映雜交種的真實純度。

圖2 引物O112-G04對西園4號及其親本的擴增結果

圖3 引物O112-G04在部分西園4號單株及其親本中的擴增結果

3 結論與討論

本試驗通過對兩種純度鑒定結果的比較分析發現，田間形態學調查與SSR標記純度鑒定結果一致，種子純度都是96.7 %。說明利用SSR標記進行純度鑒定可以準確反映雜交種的真實純度。西園4號為秋甘藍，5月下旬收獲種子，7月上旬用于生產上播種，采用田間形態學鑒定種子純度，費時、費工，且影響雜交種的及時銷售和農民生產，因此建立一套快速、準確的種子質度檢測體系是非常必要的。本試驗采用的10 μL SSR擴增反應體系與25 μL RAPD、AFLP體系相比成本較低。采用SSR標記技術進行雜交種純度鑒定實質是檢測雜交種及其親本基因組DNA的差異，檢測所需時間短，對DNA的質量要求不高，結果準確、穩定，不受環境等因素的限制。

本試驗利用SSR標記篩選出穩定的O112-G04引物，構建了西園4號及其親本的DNA指紋圖譜，其鑒定結果與田間純度鑒定結果一致，利用SSR標記建立的快速種子純度檢測體系鑒定甘藍種子純度是可行的，為辨別和鑒定假冒偽劣種子提供科學依據。

方宣鈞，劉思衡，江樹業.2000.品種純度和真偽的DNA分子標記及其應用.農業生物技術學報，（2）:106-110.

李召華，朱克永，陳祖武，詹慶才.2006.SSR分子標記技術在雜交水稻種子純度鑒定中的應用.雜交水稻，21（4）:11-14.

司軍，李成瓊，宋洪元，任雪松，宋明，王小佳.2009.結球甘藍SSR檢測體系的建立及優化.中國蔬菜，（12）:19-23.

田雷，曹鳴慶，王輝，郭晶心，周乃元，孫江，賈希海.2001.AFLP標記技術在鑒定甘藍種子真實性及品種純度中的應用.生物技術通報，（3）:38-40.

王掌軍，馬駿.2008.甜瓜基因組DNA的提取及質量檢測.寧夏農林科技，（3）:29-30.

莊木，王曉武，楊麗梅，劉玉梅，孫培田，方智遠.1999.利用RAPD方法鑒定兩個春甘藍品種的純度.中國蔬菜，（5）:8-9.

Yashitola J，Thirumurugan T，Sundara R M，Naseerullah M K，Ramesha M S，Sarma N P，Sonti Ramesh V.2002.Assessment of purtity of rice hybrids using microsatellite and STS markers.Crop Science，42（4）:1369-1373.

Identification of Cabbage‘Xiyuan No.4’Seed Purity by SSR Markers

MIAO Ming-jun1,2, LI Cheng-qiong1*, SI Jun1, REN Xue-song1, SONG Hong-yuan1
（1College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Key Lab in Olericulture of Chongqing,Key Lab of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing400715, China;2Horticulture Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences Chengdu610066, Sichuan, China）

Cabbage（Brassica oleracea L. var. capitata L.）‘Xiyuan No.4’and its parent were analyzed by SSR molecular marker technology. A primer, with obvious different bands parent, O112-G04 was screened from90 pairs of SSR primers. The DNA fingerprinting of cabbage‘Xiyuan No.4’was constructed, and its seed purity was identified. The result is consistent with those obtained in the field tests. The seed purity was96.7 %.This result shows that it is reliable to use this pair of SSR primer to identify cabbage‘Xiyuan No.4’seed purity.

Cabbage; SSR marker; Purity test

S635.1

A

1000-6346（2011）02-0053-03

2010-06-25；接受日期:2010-10-09

重慶市科委攻關項目（CSTC,2010AA1023），農業科技成果轉化資金項目（2009F10010355），西南大學博士基金資助項目（SWUB2008058），中央高校基本科研業務費資金項目（XDJK2010C068，XDJK2010C069）

苗明軍，男，碩士研究生，專業方向:蔬菜遺傳育種與生物技術，E-mail:miaomingjun11@126.com

*通訊作者（Corresponding author）:李成瓊，教授，專業方向:蔬菜遺傳育種與生物技術，E-mail:chqli@swu.edu.cn