嫁接對西瓜根際微生物種群數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響

雷娟利 壽偉松 董文其 張成浩 徐志豪 周艷虹 喻景權(quán)

（1浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2浙江大學園藝系，浙江杭州 310029）

嫁接對西瓜根際微生物種群數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響

雷娟利1壽偉松1董文其1張成浩1徐志豪1周艷虹2喻景權(quán)2

（1浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2浙江大學園藝系，浙江杭州 310029）

分別采用微生物培養(yǎng)的方法、16S rDNA PCR-RFLP方法和phl D基因PCR-RFLP方法研究了嫁接對西瓜根際微生物種群數(shù)量、細菌群落結(jié)構(gòu)及拮抗菌（2,4-DAPG產(chǎn)生菌）群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:① 嫁接西瓜根際細菌和真菌數(shù)量有所提高，而放線菌數(shù)量則有所減少。② 嫁接西瓜與自根西瓜具有1個相同的主要根際細菌基因型；不同砧木嫁接的西瓜與自根西瓜也分別具有不同基因型的細菌。③ 嫁接西瓜具有與自根西瓜不同的主要根際拮抗菌基因型。

西瓜嫁接；根際微生物；細菌；群落結(jié)構(gòu)；2,4-DAPG產(chǎn)生菌

西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕是我國主要經(jīng)濟作物，全國各地常形成連片種植的西瓜種植區(qū)域和特色基地。由于市場需求和有限耕地面積的矛盾，以及栽培習慣和經(jīng)濟利益的影響，連作現(xiàn)象普遍，造成連作障礙與枯萎病等病害發(fā)生十分嚴重。西瓜枯萎病是一種分布較廣、危害嚴重、防治困難的一種典型土傳病害。嫁接作為克服土傳病害，消除連作障礙的一項有效技術(shù)措施，在西瓜生產(chǎn)上已得到廣泛應(yīng)用（韓志平 等，2006）。根際微生物群落結(jié)構(gòu)與土傳病害的發(fā)生有一定的內(nèi)在聯(lián)系，植物土傳病害的發(fā)生在一定程度上是根際微生物群體相互作用的結(jié)果。研究表明嫁接改變了茄子根際微生物種群數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，增加了有益菌數(shù)量，進而增強了茄子的抗病性（尹玉玲 等，2008）。然而對于嫁接西瓜根際微生物與土傳病害關(guān)系方面的研究報道較少。本試驗通過對嫁接西瓜根際細菌、真菌、放線菌、種群數(shù)量變化及根際細菌與拮抗菌（2,4-DAPG產(chǎn)生菌）群落結(jié)構(gòu)變化的研究，闡明嫁接西瓜根際微生物種群結(jié)構(gòu)與土傳病害的關(guān)系，旨在從根際微生物角度進一步揭示嫁接西瓜的抗病機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

接穗為早佳8424西瓜（商品種），砧木分別為南瓜（Cucurbita. moschata Duch.）砧明秀（商品種）和葫蘆〔Lagenaria siceraria（Molina）Standl.〕砧 PH1/PH16，均由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）生理小種1（Race1）作為接種源。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細菌的分離和培養(yǎng)，馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基用于真菌的分離和培養(yǎng)，高氏1號培養(yǎng)基用于放線菌的分離和培養(yǎng)（趙斌和何紹江，2002）。

1.2 取樣方法

根際土壤的取樣方法:將根系挖出，抖落大土塊，收集附著在根系上的土壤作為根際土壤。每6株植株根際土壤混合為一個小樣，每個處理取3個平行樣，分別裝入保鮮袋中備用。微生物的分離采用土壤稀釋分離法，每種微生物稀釋濃度均分離3皿（即3次重復(fù)）。土壤含水量采用烘干法測定。最后計算每克干土中根際微生物的數(shù)量。

1.3 嫁接西瓜對西瓜枯萎病的抗性鑒定

本試驗于2008年在浙江省農(nóng)業(yè)科學院水培基地進行，采用插接法嫁接，種植土壤采自基地試驗田。采用盆栽試驗，自根西瓜、南瓜砧嫁接西瓜和葫蘆砧嫁接西瓜，分別種30盆，每盆1株，采用灌根法（張學煒 等，1991）進行西瓜枯萎病抗性鑒定，接種后30 d左右調(diào)查發(fā)病率。

1.4 根際微生物總基因組DNA提取

根際微生物總基因組DNA的提取采用UltraClean Soil DNA isolation Kit（Mo Bio Laboratories，Solana Beach Calif，USA），具體操作方法見說明書。提取的DNA大小和質(zhì)量通過0.8 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 根際細菌PCR-RFLP分析

根據(jù)Martin-Laurent等（2001）設(shè)計細菌16S rDNA近全長引物（表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴增反應(yīng)在50 μL體系中進行，其中含1 μL（約20 ng）DNA樣品，1.5 mmol·L-1MgCl2，0.25 μmol·L-1正反向引物，400 μmol·L-1dNTPs，1 U Taq DNA 聚合酶及1倍的反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)程序為:94 ℃變性3 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物長約1.5 kb。PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將特異性的目的片段用北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司的試劑盒進行切膠純化。純化后的PCR產(chǎn)物與PMD19-T vector（Takara公司）連接過夜，然后轉(zhuǎn)化 TG1感受態(tài)細胞，挑取白斑篩選陽性克隆。將篩選到的陽性克隆質(zhì)粒 DNA，取0.5 μL為模板，采用M13引物再進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物用HinfⅠ和HaeⅢ兩種限制性內(nèi)切酶37 ℃，4 h進行酶切，酶切完成后用2 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，即獲得限制性片段長度多態(tài)性圖譜。對于條帶數(shù)目與位置相同的，認為其來源于同一細菌16S rDNA PCR-RFLP基因型。對同一基因型的克隆數(shù)進行統(tǒng)計，并計算其基因型頻率。

1.6 根際抗生素2,4-二乙酰基藤黃酚（2,4-DAPG）產(chǎn)生菌PCR-RFLP分析

根據(jù) McSpadden Gardener等（2001）設(shè)計2,4-DAPG產(chǎn)生菌的phl D基因引物B2BF/BPR4。PCR退火溫度為60 ℃，擴增產(chǎn)物長約600 bp。其余操作同1.5。

1.7 多樣性指數(shù)計算

香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）和辛普森指數(shù)（Simpson’s index）是廣泛應(yīng)用于生態(tài)學研究的參數(shù)，本試驗也采用這兩個參數(shù)來分析根際樣品的細菌群落多樣性。多樣性指數(shù)的計算通過Biodap（Biodiversity data analysis package）軟件進行分析。

表1 PCR-RFLP分析所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 嫁接西瓜抗枯萎病的鑒定結(jié)果

通過抗病性鑒定表明（表2），自根西瓜的發(fā)病率為98 %，而南瓜砧嫁接西瓜和葫蘆砧嫁接西瓜的發(fā)病率則均為0，抗病效果達到了100 %，說明嫁接西瓜具有對西瓜枯萎病菌Race1免疫的效果。

2.2 嫁接對西瓜根際微生物種群數(shù)量的影響

通過對嫁接西瓜根際微生物種群數(shù)量的分析表明，嫁接西瓜根際細菌和真菌數(shù)量有所提高，而放線菌數(shù)量則有所減少（表3）。

2.3 嫁接對西瓜根際細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

嫁接西瓜根際細菌16S rDNA PCR-RFLP分析表明（圖1），自根西瓜和嫁接西瓜根際共檢測到18個細菌基因型，嫁接西瓜與自根西瓜具有1個共同的根際主要細菌基因型，為基因型2，基因型頻率均達到或超過70 %。不同砧木嫁接的西瓜與自根西瓜也分別具有不同基因型的細菌，如自根西瓜具有8個特有的基因型；南瓜砧嫁接西瓜具有3個特有的基因型；葫蘆砧嫁接西瓜具有1個特有的基因型。從基因型數(shù)來看，自根西瓜的根際細菌基因型數(shù)最多為12，而南瓜砧和葫蘆砧嫁接西瓜的基因型數(shù)則分別為9和5。從多樣性指數(shù)來看，南瓜砧嫁接西瓜與自根西瓜的根際細菌多樣性較高，而葫蘆砧嫁接西瓜的較低（表4）。

表2 嫁接西瓜抗枯萎病鑒定結(jié)果

表3 嫁接對西瓜根際主要微生物種群數(shù)量的影響 （DW）

圖1 不同砧木嫁接西瓜根際細菌16S rDNA基因型及其頻率

2.4 嫁接對西瓜根際2,4-DAPG產(chǎn)生菌群落結(jié)構(gòu)的影響

嫁接西瓜根際2,4-DAPG產(chǎn)生菌phl D基因PCR-RFLP分析表明（圖2），共檢測到12個抗生菌基因型，嫁接西瓜與自根西瓜具有不同的主要根際抗生菌基因型，自根西瓜根際抗生菌主要基因型為基因型2，基因型頻率為65 %；而南瓜砧和葫蘆砧嫁接西瓜根際抗生菌的主要基因型均為基因型9，基因型頻率分別為61 %和82 %。自根西瓜與嫁接西瓜共有的抗生菌基因型僅有2個，基因型2（自根西瓜與葫蘆砧嫁接西瓜共有），基因型6（自根西瓜與南瓜砧嫁接西瓜共有）。自根西瓜特有的基因型有5個，南瓜砧與葫蘆砧嫁接西瓜共有的基因型有4個，南瓜砧嫁接西瓜特有的基因型有1個，而葫蘆砧嫁接西瓜未檢測到特有的基因型（圖2）。從基因型數(shù)來看，自根西瓜的抗生菌基因型數(shù)最多為7，而南瓜砧和葫蘆砧嫁接西瓜的抗生菌基因型數(shù)則分別為6和5。從多樣性指數(shù)來看（表5），南瓜砧嫁接西瓜與自根西瓜的根際抗生菌多樣性較高，而葫蘆砧嫁接西瓜的較低。這一結(jié)果與根際細菌多樣性的結(jié)果相似。

表4 嫁接對根際細菌多樣性的影響

圖2 不同砧木嫁接西瓜根際2,4-DAPG產(chǎn)生菌phl D基因型及其頻率

3 結(jié)論與討論

表5 嫁接對根際2,4-DAPG產(chǎn)生菌多樣性的影響

根際微生物與植物生長有著密切的關(guān)系，對植物生長具有十分重要的作用（Smith &Goodman，1999）。根際微生物群落結(jié)構(gòu)與土傳病害的發(fā)生也存在著一定的內(nèi)在聯(lián)系，植物土傳病害的發(fā)生在一定程度上是根際微生物群體相互作用的結(jié)果。其中，根際細菌與植物的關(guān)系最為密切，對植物的影響作用也最大。有研究表明嫁接茄和自根茄根系分泌物中氨基酸和酚酸在數(shù)量和組成上存在差異，進而影響茄子根際微生物的區(qū)系組成，而且嫁接茄子根際微生物總量也有所增加（朱麗霞 等，2003）。本試驗發(fā)現(xiàn)，嫁接西瓜根際細菌和真菌數(shù)量有所提高，而放線菌數(shù)量則有所減少。通過根際細菌16S rDNA RFLP分析發(fā)現(xiàn)，嫁接也可引起西瓜根際細菌群落發(fā)生輕微改變。

許多研究表明，抑制病害發(fā)生的土壤與熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）有一定的關(guān)系（Weller et al.，2007）。熒光假單胞桿菌是一類普遍存在于土壤中的微生物，是一類重要的根圍和葉圍細菌。其中，產(chǎn)生2,4-DAPG的熒光假單胞桿菌對抑制各類土傳病害起著重要的作用（Raaijmakers et al.，2002）。既然2,4-DAPG產(chǎn)生菌在土壤中廣泛存在，且在抑制土傳病害方面起著重要的作用，因此2,4-DAPG產(chǎn)生菌的基因型及基因型多樣性也被廣泛研究（de La Fuente et al.，2006）。Phl D基因是許多參與DAPG合成的基因中最重要的一個，它對DAPG前體的合成很重要（Bangera & Thomashow，1999）。研究發(fā)現(xiàn)，phl D基因在所發(fā)現(xiàn)的2,4-DAPG產(chǎn)生菌中具有保守性，同時也具有一定的多態(tài)性，很適合作為目的基因研究2,4-DAPG產(chǎn)生菌的基因型多樣性。RFLP和DGGE分析phl D基因已被用于研究2,4-DAPG產(chǎn)生菌的多樣性上（Bergsma-Vlami et al.，2005）。本試驗通過phl D基因的PCR-RFLP技術(shù)，對嫁接西瓜根際2,4-DAPG產(chǎn)生菌的基因型多樣性進行了分析，嫁接對西瓜根際2,4-DAPG產(chǎn)生菌的基因型多樣性影響顯著，嫁接西瓜具有與自根西瓜截然不同的根際主要2,4-DAPG產(chǎn)生菌的基因型，據(jù)試驗結(jié)果推測嫁接西瓜具有不同的主要2,4-DAPG產(chǎn)生菌的基因型可能與嫁接西瓜的抗枯萎病相關(guān)，當然確切的結(jié)論還有待進一步研究。

韓志平，郭世榮，朱國榮，歐陽認勇.2006.砧木對嫁接西瓜生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響.中國蔬菜，（2）:22-23.

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Effects of Grafting on Rhizosphere Microorganisms Quantity and Community Structure of Watermelon

LEI Juan-li1, SHOU Wei-song1, DONG Wen-qi1, ZHANG Cheng-hao1, XU Zhi-hao1, ZHOU Yan-hong2,YU Jing-quan2
（1Vegetable Institute of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou310021, Zhejiang, China; 2Horticulture Department of Zhejiang University, Hangzhou310029, Zhejiang, China）

The changes of microorganisms population, bacterial community structure and2,4-DAPG producers community structure in rhizosphere soil of grafted watermelon〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕plants were studied using the methods of microorganism culture,16S rDNA PCR-RFLP and phl D gene PCR-RFLP, respectively. The results showed that the bacterial and fungal population in rhizosphere soil of grafted watermelon was increased and that of the actinomyces population was decreased;the grafted watermelon had one similar main16S rDNA genotype in rhizosphere soil with the non-grafted watermelon, although the grafted watermelon with different stock had their unique16S rDNA genotypes different from non-grafted watermelon; the grafted watermelon had different main2,4-DAPG producers phl D genotypes from non-grafted watermelon.

Grafted watermelon; Rhizosphere microorganism; Bacteria; Community structure;2,4-DAPG producers

S436.5

A

1000-6346（2011）02-0062-05

2010-08-06；接受日期:2010-11-03

國家科技支撐計劃（2008BADA6B02），浙江省自然科學基金（Y3100003）

雷娟利，博士，副研究員，專業(yè)方向:蔬菜病原微生物及蔬菜生物技術(shù)，E-mail:juanlil@126.com