平臺掃描儀結合ImageJ軟件測定番茄葉面積

高建昌 郭廣君 國艷梅 王孝宣 杜永臣

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

平臺掃描儀結合ImageJ軟件測定番茄葉面積

高建昌 郭廣君 國艷梅 王孝宣 杜永臣*

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

利用掃描儀獲取標準圖形，對ImageJ軟件測定番茄葉面積的準確性進行了驗證。發現不同的掃描分辨率（100、200和300DPI）對圖形面積沒有顯著影響，200DPI的分辨率為較好的掃描參數。以番茄葉片為試材，對剪紙法與圖像處理法進行比較，發現二者差異不顯著。在此基礎上，建立了一種掃描儀結合ImageJ軟件測定番茄葉面積的方法。

掃描儀；ImageJ；圖像處理；分辨率；番茄；葉面積

葉片是植物地上部與外部環境進行交互的重要部分，是植物進行光合作用、蒸騰作用和呼吸作用的主要器官。而葉面積是生理生化、遺傳育種以及作物栽培的重要測定指標。葉面積的準確測定對于深入研究光合效率、蒸騰速率和逆境脅迫等生理指標有重要意義。

目前常用的葉面積測定方法主要有光電測定法、剪紙法、打孔測定法、排水量測定法、系數測定法、數格測定法等（喬富廉，2002），各有優缺點。近年來，隨著數碼照相技術以及計算機圖像處理軟件發展，研究者建立了一些基于數碼照相和掃描儀結合 Photoshop軟件測定葉面積的方法（肖強 等，2005；李寶光 等，2006；石景蓀 等，2007）。相比傳統的方法，利用電腦軟件測定植物葉面積受人為因素影響較小，葉片形狀、顏色、厚薄等對測定結果無顯著影響；同時測定方法快速簡便，適用范圍廣。

基于圖像處理軟件測定葉面積主要是通過分析圖片的分辨率（DPI，Dot Per Inch，指單位長度內的像素數目，1英寸=2.54 cm）來實現的。ImageJ（V1.43）（Wayne Rasband，2010）是由美國國家心理健康研究所的Wayne Rasband博士開發的一款圖像處理和分析軟件，該軟件可以處理TIFF、GIF、JPEG、BMP、DICOM、FITS等圖像格式，能實現對圖片像素的獲取直接輸出葉面積大小。相比采用Photoshop軟件，步驟簡單，無需編程就可實現大量樣品的處理，更為快捷。

本試驗旨在探討采用掃描儀和ImageJ軟件測定番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）葉面積的準確性，建立一種可以快速處理大量番茄葉面積的方法。

1 材料與方法

1.1 掃描儀和ImageJ軟件測定標準圖形面積

標準圖形的制備:采用Photoshop或其他軟件繪制4個面積不等的正方形和4個面積不等的直角三角形，黑色填充，用直尺測量邊長，記錄，計算每個圖形的面積。

掃描儀采用HP M1522n，分別以100DPI、200DPI、300DPI進行掃描。

ImageJ測定面積步驟如下:打開ImageJ軟件，Open打開目標文件；Analyze/Set scale，設定對話框；Image/color/split channels，采用Blue通道進行下一步；Image/Adjust/Threshold，紅色自動填充；Analyze/Analyze Particles，設定對話框，點擊“OK”輸出結果。

1.2 試驗驗證

取完全展開的番茄葉片3片，將其平鋪于兩片透明膠片紙之間，掃描，利用ImageJ軟件統計葉面積，3次重復。將掃描照片打印，稱質量（打印紙質量記為W總），測量A4紙面積（記為S總），沿葉緣將圖像準確剪下，稱質量（質量記為W測）。按照比例計算出葉面積，計算公式為S測=W測/W總×S總。3次重復。

1.3 數據分析

采用Excel軟件進行數據匯總，利用DPS軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同分辨率對面積測定的影響

分辨率是決定掃描儀獲取圖片數字圖像像素數目的最主要因素，有研究表明圖片像素隨掃描儀分辨率的提高呈幾何級數增長（李寶光 等，2006），而圖像處理軟件是通過獲取像素來測定面積的，在一定范圍內分辨率會對面積有一定的影響。為了確定分辨率對面積測定的影響，本方法采用自制色塊圖形進行研究。在一張A4紙上用Photoshop軟件繪制4個大小不等的正方形和4個直角三角形，分別用100DPI、200DPI和300DPI的分辨率掃描3次，ImageJ軟件測定面積。利用DPS軟件進行統計分析，Duncan新復極差法進行多重比較，結果如表1。

從表1可以看出，不同分辨率對測定同一圖形的面積沒有顯著影響，試驗中僅在測定Tri4面積時發現采用300DPI掃描的圖片面積與100DPI和200DPI存在顯著差異，但沒達到極顯著水平，可能為機械誤差所致。而且300DPI掃描的圖片面積較其他兩種方式偏大。同時，比較變異系數可以看出，圖片面積越小，變異系數越大，具體原因尚不清楚。

較低的分辨率意味著較快的掃描速度，但會損失一定的掃描精度。在分辨率對面積影響無顯著差異的情況下，本試驗認為采用200DPI進行面積測定為較好的選擇。

2.2 圖像處理方法與圖形測量方法的比較

將2.1中繪制的圖片打印3份，分別測量8個圖形的邊長，計算其面積。將結果與200DPI掃描后計算的圖片面積進行比較（表2）。兩種方法差異不顯著，說明基于掃描儀結合ImageJ軟件測定圖片面積是可行的，而且圖像處理方法較圖形測量方法的變異系數偏小，說明采用圖像處理方法誤差更小，更準確。

表1 掃描儀分辨率對面積測定的影響

表2 不同面積測定方法的比較

2.3 試驗驗證

本試驗中對傳統的剪紙法進行了改進，首先利用掃描儀掃描葉片，然后打印再沿葉緣進行裁剪稱質量。

分別用圖像處理法（200DPI）和剪紙法測定相同的3片番茄葉片，結果如表3。結果顯示兩種方法在測定番茄葉面積時差異不顯著，即圖像處理法是切實可行的。并且采用圖像處理法較傳統的剪紙法變異系數更小，說明圖像處理法穩定性更好。

表3 不同測定方法測定番茄葉面積

3 結論與討論

3.1 掃描儀結合ImageJ軟件測定番茄葉面積的方法

綜合上述試驗結果，筆者建立了一種掃描+軟件分析的番茄葉面積測定方法，具體如下。

① 掃描:選取待測番茄葉片，平鋪于兩張透明膠片紙之間，采用 HP M1522n（或其他掃描儀）以200DPI的分辨率進行掃描，保存文件（建議保存為JPEG格式）。

② ImageJ軟件分析步驟:

Ⅰ打開文件:

Ⅲ Image/color/split channels

此處將待測葉片分成紅（Red）、綠（Green）和藍（Blue）三個通道，任選一個即可。本試驗選取藍（Blue）通道進行分析。

Ⅳ Image/Adjust/Threshold

本步驟自動用紅色塊將待測葉面積填充。

Ⅴ Analyze/Analyze Particles

此方法用于計算葉面積，點擊后按下圖所示進行設置。如果需要計算總面積，可勾選Summarize。點擊OK，輸入結果。該結果可以保存也可直接復制粘貼至Excel表中進行處理。

3.2 討論

在傳統的葉面積測定方法中，除葉面積儀法和葉面積系數法外，其他方法都是在破壞植物組織的基礎上進行的。本試驗中由于采用了平臺掃描儀，同樣對植物葉片進行了破壞性取樣。但是如果采用數碼相機（外加標尺）或者手持式掃描儀取樣，就可以避免破壞植物組織。

本試驗用簡單實用的剪紙法與圖像處理法進行比較，發現剪紙法雖然簡單，但受葉片形狀、紙張均勻度以及人為因素影響較大，盡管采用打印的方法替代手工描繪，但人為剪紙的精度對結果影響較大，變異度偏高。對于大量的樣品，則費工費力。葉面積儀是公認的較好的方法，但葉面積儀一次性投入過高，即便是便攜式葉面積儀其測定結果受掃描速度影響過大，從而限制了其普及推廣。圖片像素分析結合圖像處理軟件是較為理想的方法，國內的研究者研究了利用Photoshop軟件進行葉面積分析的方法，但其方法過于繁瑣，需要人工選取目標區域，增加了人為誤差，同時采用Photoshop軟件不能對測定結果進行自動記錄和自動輸出，影響了其應用。ImageJ軟件則克服了上述問題，所有步驟均有電腦自動完成，僅需簡單的設置就可以完成對大量樣品的處理（Tiago & Wayne Rasband，2010），同時可以自動輸出計算結果，便于進一步分析，更為快捷。

李寶光，陶秀花，倪國平，黃冬華，宋小民.2006.掃描像素法測定植物葉面積的研究.江西農業學報，18（3）:78-81.

喬富廉.2002.植物生理學實驗分析測定技術.北京:中國農業科學技術出版社:67-70.

石景蓀，左啟華，張濤，張立峰，邊秀舉.2007.圖像處理技術在唐菖蒲葉面積測定中的應用.中國農學通報，23（5）:456-460.

肖強，葉文景，朱珠，陳瑤，鄭海雷.2005.利用數碼相機和Photoshop軟件非破壞性測定葉面積的簡便方法.生態學雜志，24（6）:711-714.

Tiago A F，Wayne Rasband.2010.http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf.

Wayne Rasband.2010.http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html.

Measuring Plant Leaf Area by Scanner and ImageJ Software

GAO Jian-chang, GUO Guang-jun, GUO Yan-mei, WANG Xiao-xuan, DU Yong-chen*
（Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100081, China）

The accuracy of measuring tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）leaf area by ImageJ software was confirmed through measuring scanned standard shape. There was no significant difference for area with100,200 and300 DPI. And200 DPI was better. Two methods of paper-cutting and image processing for measuring tomato leaf area were compared and there was no significant difference. Based on the result, the method of measuring tomato leaf area with scanner and ImageJ software was established.

Scanner; ImageJ software; Image processing ; DPI; Tomato; Leaf area

S641.2

A

1000-6346（2011）02-0073-05

2010-09-04；接受日期:2010-11-01

國家自然科學基金項目（30900987），國家“973”項目子課題（2009CB009004-02），中國農業科學院基本科研業務費項目，農業部園藝作物遺傳改良重點開放實驗室

高建昌，男，助理研究員，專業方向:蔬菜遺傳育種，E-mail:gaojch@mail.caas.net.cn

*通訊作者（Corresponding author）:杜永臣，男，研究員，博士生導師，專業方向:蔬菜遺傳育種，E-mail:yongchen.du@mail.caas.net.cn