酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化

聶建軍，李彩萍，楊玉畫，李兆斌

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西太原030006）

酒紅球蓋菇（Stropharia rugoso-annulate）又名大球蓋菇、皺環(huán)球蓋菇，是國際菇類交易市場上十大菇類之一，也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）向發(fā)展中國家推薦栽培的特色品種之一[1]。近年來栽培推廣情況表明，酒紅球蓋菇具有非常廣闊的發(fā)展前景，栽培技術(shù)簡單粗放，可直接采用生料或發(fā)酵料栽培，具有極強(qiáng)的抗雜菌能力，栽培成功率高，原料來源豐富。但在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)酒紅球蓋菇制種周期為90～100 d，比一般食用菌制種周期長1倍多，極大地制約了酒紅球蓋菇的大面積栽培推廣。而采用液體搖瓶種制備原種的方法，制種周期比傳統(tǒng)制種縮短了將近1/2，僅為50 d左右，可以有效解決這一生產(chǎn)實(shí)踐中的難題。

本研究對(duì)酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基最佳碳源、氮源和最佳碳、氮源組合進(jìn)行了篩選，選出了適宜酒紅球蓋菇菌絲生長的液體搖瓶最佳培養(yǎng)基，以期為酒紅球蓋菇液體搖瓶菌種的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

供試菌種為酒紅球蓋菇（S tropharia rugosoannulate），引自福建省三明市真菌研究所。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基 采用馬鈴薯綜合培養(yǎng)基[2]。

1.2.2 碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基 蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH值自然。

1.2.3 氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH值自然。

1.2.4 試驗(yàn)培養(yǎng)基 將葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖和山梨糖分別加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（濃度均為2%），進(jìn)行碳源優(yōu)化試驗(yàn)；將蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨、尿素和麩皮分別加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（濃度均為1%），進(jìn)行氮源優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基 根據(jù)1.2.4中碳、氮源的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇較好的碳、氮源各2個(gè)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。以蔗糖（A）和可溶性淀粉（B）為復(fù)合碳源，蛋白胨（C）和麩皮（D）為復(fù)合氮源，采用4因素3水平正交試驗(yàn)方法，篩選出酒紅球蓋菇液體搖瓶最佳培養(yǎng)基[3]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與純化培養(yǎng) 將酒紅球蓋菇菌種從冰箱中取出后，25℃下恒溫放置7 d，使處于低溫中的菌種活化；無菌條件下把活化菌種接種于馬鈴薯綜合培養(yǎng)基平板上，28℃下恒溫培養(yǎng)3～4 d，之后挑取強(qiáng)壯菌絲體前端，接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃下恒溫培養(yǎng)至斜面長滿，得到一級(jí)菌種備用[4]。

1.3.2 碳（氮）源篩選試驗(yàn) 取3塊0.5 cm2一級(jí)酒紅球蓋菇菌種，分別接種于6種不同碳（氮）源培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基40mL，使氣生菌絲一面向上懸浮，28℃下靜置24 h；然后放入往復(fù)式恒溫振蕩器內(nèi)，28℃，150 r/min條件下培養(yǎng)5 d[5]。每種碳（氮）源試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 正交試驗(yàn)篩選最佳培養(yǎng)基配方 取3塊0.5 cm2一級(jí)酒紅球蓋菇菌種，分別接種于正交試驗(yàn)9個(gè)不同處理的培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基40mL，使氣生菌絲一面向上懸浮，28℃下靜置24 h；然后放入往復(fù)式恒溫振蕩器內(nèi)，28℃，150 r/min條件下培養(yǎng)5 d。每次試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。試驗(yàn)因素及其各水平如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)的因素及水平 %

1.4 測定方法

1.4.1 菌球密度的測定[6]使用血球計(jì)數(shù)板觀測每毫升培養(yǎng)液內(nèi)的菌球個(gè)數(shù)。

1.4.2 菌球直徑的測定[7]隨機(jī)取菌球30個(gè)，排列成直線，并測其總長度，求得菌球的平均直徑。

1.4.3 生物量的測定[8]取50 mL培養(yǎng)液，過0.42mm篩，菌絲體經(jīng)蒸餾水充分洗滌后，80℃真空干燥至恒質(zhì)量，電子天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量。計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選試驗(yàn)結(jié)果

從碳源篩選試驗(yàn)結(jié)果（表2）可以看出，蔗糖作為碳源，其平均菌絲體生物量最高，達(dá)7.26 g/L；平均菌絲球密度最大，為162個(gè)/mL；平均菌絲球直徑較小，為1.19mm。綜合比較，蔗糖作為酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基碳源效果最佳，其次是可溶性淀粉、葡萄糖等。

2.2 氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果

從氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果（表3）可以看出，麩皮作為氮源，其平均菌絲體生物量最高，達(dá)6.98 g/L；平均菌絲球密度較大，為138個(gè)/mL；平均菌絲球直徑較小，為1.30mm。綜合比較，麩皮作為酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基氮源效果最佳，其次是蛋白胨、酵母膏等。

表2 不同碳源對(duì)酒紅球蓋菇菌絲體生長的影響

表3 不同氮源對(duì)酒紅球蓋菇菌絲體生長的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基結(jié)果

從L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析（表4）可以得出，影響酒紅球蓋菇菌絲體生物量的因素依次為A＞D＞C＞B，即蔗糖＞麩皮＞蛋白胨＞可溶性淀粉；酒紅球蓋菇液體搖瓶最佳培養(yǎng)基組合為A2B1C2D2，即蔗糖2%，可溶性淀粉1%，麩皮2%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是麩皮。麩皮來源廣泛、價(jià)格低廉、營養(yǎng)豐富，是大規(guī)模生產(chǎn)酒紅球蓋菇液體菌種的最佳原料。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，可溶性淀粉作為酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基復(fù)合碳源，一方面可以作為碳營養(yǎng)被吸收和利用，另一方面前期可以作為增稠劑來提高培養(yǎng)液黏度，減小菌球直徑，增加菌球數(shù)量，到后期可溶性淀粉被消耗而使培養(yǎng)液變稀，這樣的菌種接到固體培養(yǎng)基上透氣性好，有利于菌種的萌發(fā)和吃料。

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選酒紅球蓋菇液體搖瓶培養(yǎng)基配方，結(jié)果表明，酒紅球蓋菇液體搖瓶最佳培養(yǎng)基為蔗糖2%，可溶性淀粉1%，麩皮2%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%。

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