混合拮抗菌防治葡萄白腐病培養(yǎng)基的優(yōu)化

齊牧遙，趙 丹，王 芬，謝 云，陳五嶺

（西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069）

美國紅提葡萄又名美國紅提、晚紅、大紅球，是美國加州大學(xué)育成的優(yōu)質(zhì)葡萄新品種，晚熟[1-2]，它以個大、色艷、肉厚、味甜、質(zhì)優(yōu)、耐貯等優(yōu)良性狀而著稱，深受廣大人民群眾的喜愛。但是，紅提葡萄屬歐亞品種，抗病性較差，不抗多種病害，在多雨的年份或栽植在溫暖濕潤的地區(qū)，其主要病害尤其是真菌性病害發(fā)生嚴(yán)重，病害一旦蔓延，對產(chǎn)量、品質(zhì)、效益影響較大，造成許多果園減產(chǎn)甚至面臨毀園的危險，因此，防治病害至關(guān)重要[3-4]。

目前，紅提葡萄的主要病害為葡萄黑痘病、葡萄霜霉病、葡萄白腐病，防治措施主要為套袋或者化學(xué)防治，但其往往會帶來人力成本過高、用藥盲目、超濃度用藥等問題[5-6]。由于生物防治技術(shù)具有安全、無污染、無殘留等特點(diǎn)，越來越受到人們的廣泛關(guān)注。葡萄白腐病又稱腐爛病，全世界均有分布，它是紅提葡萄主要的真菌性病害之一。該病常年發(fā)生，一般年份會造成減產(chǎn)15%～20%，在流行年份達(dá)到60%以上，是紅提葡萄病害中造成損失最重、危害最大的一種病害[7-8]。Guetsky等[9]證實(shí)，不同的拮抗微生物具有不同的功能，混合使用比單獨(dú)使用效果更好。

本試驗選取紅提葡萄真菌性病害中發(fā)生頻率最高、范圍最廣、病害嚴(yán)重性最強(qiáng)的白腐病的拮抗菌作為研究對象，將實(shí)驗室已有的2種拮抗菌混合培養(yǎng)，從而獲得拮抗能力更強(qiáng)的混合拮抗菌液，并嘗試優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高混合菌液的拮抗能力，旨在為進(jìn)一步配制復(fù)合生防菌肥、無公害防治葡萄白腐病打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌PT2′（由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗室誘變得到，保存于4℃冰箱），QM34（由西北大學(xué)胡青平博士篩選并予以鑒定），葡萄白腐病病原指示菌（為西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗室保藏菌種）。

1.1.2 培養(yǎng)基 搖瓶種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，葡萄糖 5.0，牛肉膏 5.0，NaCl5.0，MgSO4·7H2O 0.15，MnCl2·7H2O 0.01。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉膏 3.0，NaCl15.0，瓊脂 20.0。

玉米粉液體培養(yǎng)基：糖化酶（2 000單位），α-淀粉酶（2 000 單位），玉米粉，KH2PO4，CO（NH2）2。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨 10.0，NaCl15.0。

以上培養(yǎng)基使用的試劑均為化學(xué)純，調(diào)整pH值為7.0，121℃下滅菌30min。

1.1.3 儀器設(shè)備 超凈臺SW-CJ-1F，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-40BI，上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫干燥箱GZX-DH 400-BS-Ⅱ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；顯微鏡Eclipse E200，尼康公司；電子天平Sartorius BS210S，北京賽文利斯；培養(yǎng)箱MJ-160-Ⅱ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；分光光度儀UV-2401，PC。

1.2 試驗方法

1.2.1 最佳發(fā)酵條件的確定

1.2.1.1 最佳培養(yǎng)基的選擇 將菌種PT2′及QM34按照接種量各1%混合，分別接種于裝有無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、無菌搖瓶種子培養(yǎng)基和無菌玉米粉液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，做好標(biāo)記。然后將3個錐形瓶置于30℃，200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。重復(fù)3次。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基生物量測量 取1.2.1.1的3種發(fā)酵液各1mL，于5mL無菌水中稀釋后，分別取1mL，在660 nm下測定吸光值，標(biāo)記為A660，每種發(fā)酵液重復(fù)測定3次。以未接種的無菌培養(yǎng)基按照相同的取量作為空白對照。

1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基抑菌能力的觀察 于4℃，1 000 r/min離心10min得到1.2.1.1的3種發(fā)酵液的上清液，經(jīng)過微孔濾膜過濾得到無菌發(fā)酵液，以葡萄白腐病致病真菌為拮抗對象，四點(diǎn)杯碟對峙法[8]做拮抗試驗，每個平板試驗重復(fù)3次，記錄拮抗抑菌圈的大小。離心得到的3組發(fā)酵液試驗互為對照。

1.2.2 工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10]，在試驗確定的最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入低濃度的MnS，以觀察混合拮抗菌發(fā)酵液A660值以及抑菌能力的變化。

1.2.2.1 最佳培養(yǎng)基的優(yōu)化 用SPSS 19.0設(shè)計6因素3水平的正交表，隨機(jī)產(chǎn)生18組試驗（表1）。30℃培養(yǎng)24 h后測定A660值，然后取拮抗菌株發(fā)酵液做拮抗試驗，6 d后觀察抑菌圈的大小，重復(fù)3次。

表1 L18（36）正交設(shè)計 g/L

1.2.2.2 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行正交試驗表格設(shè)計及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)菌數(shù)變化

將PT2′與QM34混合分別接入無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、無菌搖瓶種子培養(yǎng)基和無菌玉米粉液體培養(yǎng)基中，記為N組、Z組和Y組。振蕩培養(yǎng)24 h，測定A660值，記錄發(fā)酵液中菌數(shù)變化的結(jié)果（表2）。

表2 3種培養(yǎng)基發(fā)酵液的A660值

從表2可以看出，經(jīng)過液體搖床發(fā)酵，Y組的吸光度值A(chǔ)660明顯高于Z組和N組，這說明在玉米粉液體培養(yǎng)基中，PT2′與QM34的混合發(fā)酵液含菌量最多。

以表2數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，假設(shè)Y組培養(yǎng)基中，PT2′與QM34的混合發(fā)酵液含菌量最多為正確，經(jīng)過SPSS數(shù)據(jù)分析，得到表3。

從表3可以看出，N，Z，Y這3組數(shù)據(jù)的P值均小于0.01，說明根據(jù)表2推理的假設(shè)成立，且Y組的A660較N組和Z組有顯著差異，這說明Y組的發(fā)酵液中含菌量最多，即Y組較N組和Z組發(fā)酵液更適宜混合菌的生長。

表3 3種不同培養(yǎng)基發(fā)酵液A660值差異性檢驗

2.2 3種培養(yǎng)基抑菌效果觀察

為了觀察不同培養(yǎng)基對混合菌液拮抗能力的影響，將培養(yǎng)1 d以上的PT2′與QM34的混合培養(yǎng)液制成無菌發(fā)酵液，做拮抗試驗，每種培養(yǎng)基3組重復(fù)，記錄各組的抑菌圈直徑大小（表4、圖 1）。

表4 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果

從表4和圖1可以看出，Y組培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌圈大小高于N組和Z組，說明其拮抗能力顯著高于N組、Z組發(fā)酵液的拮抗能力。

由圖2可知，Y組發(fā)酵液的抑菌圈大小和吸光度均高于N組和Z組，由此可得出結(jié)論：PT2′與QM34在玉米粉液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，產(chǎn)生發(fā)酵液與其他2種培養(yǎng)基的相比，拮抗能力更強(qiáng)，即本試驗中玉米粉液體培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基，這為下一步培養(yǎng)基的優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 玉米粉液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高試驗確定的最優(yōu)培養(yǎng)基——玉米粉液體培養(yǎng)基的抑菌效價，我們在培養(yǎng)基中加入少量的MnS，并用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正交極差分析。

2.3.1 正交結(jié)果極差分析 從表5可以看出，當(dāng)極差分析中以吸光度值為指標(biāo)時，各因素的影響順序為：B＞A＝C＝D＞E＞F；以抑菌圈大小為指標(biāo)時，各因素的影響順序為：A＞F＞B＞E＞D＞C，但僅以此數(shù)據(jù)還不能分析確定各因素的影響大小，所以需對其再進(jìn)行方差分析來確定。

2.3.2 正交結(jié)果方差分析 分別以吸光度值A(chǔ)660和抑菌圈大小為標(biāo)準(zhǔn)，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計各因素對優(yōu)化培養(yǎng)基配比影響的顯著性結(jié)果。方差分析結(jié)果如表6和表7所示。

由表6、表7分析比較得知，以吸光度A660為衡量指標(biāo)，各因素水平之間并沒有顯著性差異；相比較，各因素水平對抑菌圈的影響較大，因此，在選擇水平的時候，將對抑菌圈的影響作為主要因素考慮。

表5 正交結(jié)果的極差分析

表6 依靠A660的方差分析結(jié)果

由表7可知，以抑菌圈大小為指標(biāo)，因素A對拮抗菌的生長有顯著性的影響，各因素影響大小順序為：A＞F＞B＞E＞D＞C，極差表中分析得到最優(yōu)組合為A2B2C2D1E1F1；表6中反映的影響順序為：B＞A＞D＞C＞E＞F，分析得到最優(yōu)組合為：A2B3C2D2E3F1。綜合極差分析及方差分析可以得出，因素A，B，D無論是對拮抗菌的吸光度值，還是抑菌圈大小都產(chǎn)生了較為穩(wěn)定的影響，同時，因素A，B表現(xiàn)出了顯著的促進(jìn)作用，而因素C，E則無顯著影響，從而確定玉米粉液體培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B3C2D2E1F1，即玉米粉150.0 g/L、糖化酶1.1 g/L、α-淀粉酶1.5 g/L、CO（NH2）25.0 g/L、KH2PO45.0 g/L。

表7 依靠抑菌圈大小的方差分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗通過對比，篩選出紅提葡萄白腐病拮抗菌PT2′與廣譜拮抗菌株QM34混合培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，并且利用SPSS軟件的分析，確定了最佳培養(yǎng)基的最優(yōu)組合，這為今后工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵打下了基礎(chǔ)。

同時通過查閱文獻(xiàn)，在混合菌株的培養(yǎng)基中加入少量的MnS，以期提高混合菌株的拮抗能力。試驗結(jié)果表明，MnS確實(shí)可以提高混合菌液的抑菌能力，但是對其中的菌量并沒有顯著影響，具體原因還有待進(jìn)一步深入研究。

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