響應面法優化蛋白酶提取貽貝蛋白的工藝參數

曹 川，包建強

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

貽貝不僅具有很高的食用價值，還富含蛋白質、多聚不飽和脂肪酸、礦物質、維生素等營養物質，具有抗疲勞、抗腫瘤、增強免疫力等保健功能。但是，隨著貽貝養殖產量的增加，如何充分高效地利用貽貝資源，開發出更多更好的深加工貽貝產品，既是貽貝產業面臨的巨大機遇，也是貽貝產業的一個挑戰[1]。因此，對于貽貝深加工利用的研究也受到越來越多科研工作者的重視[2]。

本研究主要探討不同條件下不同蛋白酶對貽貝蛋白的提取性能，旨在找出一條適合于工業化生產的貽貝蛋白的提取工藝參數，同時也可為用酶法提取其他貝類及水產品蛋白提供借鑒[3]。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 原料 新鮮貽貝，產自嵊泗貽貝養殖基地。

1.1.2 試劑 木瓜蛋白酶，上海博奧生物科技有限公司產品；風味蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司產品；中性蛋白酶、胃蛋白酶、福林試劑、三氯乙酸、甲醛等均為分析純，購于國藥試劑有限公司。

1.1.3 儀器設備 氨基酸全自動分析儀L-8800，日立公司產品；凱氏定氮儀Kjeltel2300，丹麥FOSS儀器有限公司產品；全自動粗脂肪測定儀SZF06，浙江托普儀器有限公司產品；酸度計METTLER TOLEDO FIVEEASY和分光光度計UV-1SOOPC SPECTROPHPTO METER，梅特勒托利多儀器有限公司產品；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司產品；冰箱SHARPBCD-171D，夏普公司產品；CS101-2A電熱鼓風干燥箱，重慶銀河試驗儀器有限公司產品；低速離心機，國華電器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 貽貝蛋白提取產物的制備 貽貝肉→配成溶液→調pH值→蛋白酶酶解→滅酶（95℃，10min）→離心（9 000 r/min，20min）→上清液→貽貝蛋白提取產物。

1.2.2 常規成分的測定 總蛋白質含量測定采用凱氏定氮法[4]；氨基態氮含量測定采用甲醛滴定法（GB 5511—85）[5]；脂肪含量的測定采用索氏抽提法（GB 5497—85）[6]；水分含量測定采用105 ℃恒質量法（GB 5512—85）[7]；灰分含量測定采用 550 ℃灼燒法（GB 5505—85）[8]；蛋白酶活力測定采用福林酚法[9]；氨基酸含量測定采用氨基酸全自動分析儀。

1.2.3 蛋白質回收率測定[10]標準曲線的繪制用考馬斯亮藍法[6]。樣液組分氮含量＝（A樣/A標）×C標。其中，A樣代表樣品的吸光度值，A標代表標準品的吸光度值，C標代表標準品的濃度。用凱氏定氮法分別測定上清液和酶解液中蛋白氮含量，并按下式計算：蛋白質回收率＝（上清液總蛋白氮量÷原料總蛋白氮量）×100%。

1.2.4 中性蛋白酶優化試驗因素和水平 在單因素試驗結果基礎上，綜合考慮4個因素對蛋白質回收率影響，采用Box-Behnken設計方案進行響應曲面研究，建立貽貝蛋白提取率的二次多項式數學模型。pH值，加酶量，酶解溫度，酶解反應時間 4 個自變量分別以 X1，X2，X3，X4表示（表1）。

表1 中性蛋白酶優化試驗因素和水平設置

2 結果與分析

2.1 貽貝的一般營養成分分析

稱取一定量的貽貝，分別測定蛋白質、脂肪、灰分、水分等指標，取平均值（表2）。

表2 貽貝主要成分分析

從表2可以看出，貽貝具有高蛋白、低脂肪的特點，與現代人的食品營養要求比較吻合，具有較廣的消費市場和較好的前景。由于其水分含量高，營養豐富，所以極易腐敗變質，不易存儲。因而，研究其酶解也是非常具有現實意義的。

2.2 4種外加蛋白酶酶解效果的比較

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶作為外加蛋白酶，在貽貝的酶解中使用較多，本研究將4種酶進行比較（圖1）。

由圖1可知，不同蛋白酶酶解貽貝勻漿液的蛋白質回收率存在著較大的差異。酶解時間為120min時，中性蛋白酶的酶解物顯示出強的蛋白質回收率，達51.85%；當酶解時間分別為180，240，300min時，中性蛋白酶的酶解物都表現出最強蛋白質回收率，其分別為51.95%，64.58%，71.87%。酶解時間為300min時，各蛋白酶酶解物的蛋白質回收率都達到最高，故篩選出中性蛋白酶酶解貽貝蛋白。

2.3 中性蛋白酶酶解貽貝單因素試驗

分別準確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為 1∶3，用 pH 計校正 pH 值為 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，在45℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍法在λ＝595 nm處測吸光度。重復3次，得蛋白質回收率。由圖2可知，中性蛋白酶在pH值為6.5時，其對貽貝蛋白質的回收率最大，可達71.05%。

分別準確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個250mL三角瓶中，中性蛋白酶按照0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，料液比為 1∶3，用 pH計校正pH值至6.5。在45℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍法在λ＝595 nm處測吸光度。重復3次，得到蛋白質回收率。

從圖3可以看出，中性蛋白酶在加酶量為0.6%時，其對貽貝蛋白質的回收率可達71.34%。

分別準確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為1∶3，用pH計校正 pH值至6.5。在 35，40，45，50，55℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍法在λ＝595 nm處測吸光度。重復3次，得蛋白質回收率。由圖4可知，中性蛋白酶在45℃時，其對貽貝蛋白質的回收率最大，達71.35%。

分別準確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為 1∶2，1∶2.5，1∶3，1∶3.5，1∶4，用 pH 計校正pH值至6.5。在45℃恒溫水浴鍋中提取180min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍法在λ＝595 nm處測吸光度。重復3次，得蛋白質回收率。從圖5可以看出，中性蛋白酶在料液比為1∶3時，其對貽貝蛋白質的回收率最大，為71.02%。

分別準確稱取5 g貽貝勻漿液，置于5個250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比為1∶3，用pH計校正pH值至6.5。在45℃恒溫水浴鍋中提取時間分別為60，120，180，240，300min。然后沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同樣的上清液0.5mL分別定容至50mL，用考馬斯亮藍法在λ＝595 nm處測吸光度。重復3次，得蛋白質回收率。由圖6可知，中性蛋白酶在180min時，其對貽貝蛋白質的回收率可達72.08%。但是隨著時間的延長，雖然蛋白質回收率提高了，可貽貝水解液的風味產生變化，綜合考慮應選用水浴水解180min。

2.4 中性蛋白酶酶解條件的優化

利用design expert和SAS程序對試驗進行處理分析，回歸方程的方差分析、各項的方差分析和參數估計及顯著性分析的主要結果列于表3～5。

表3 響應面試驗結果

表4 回歸方程的方差分析

表5 回歸方程的各項方差分析

二次回歸模型F值為17.777 0，P＜0.001 0；大于在0.01水平上的F值，而交互項的F值為3.393 0，小于在0.05水平的F值，說明該模型擬合結果好，一次項、二次項和交互項的F值均大于0.01水平上的F值，說明各個因素之間的交互作用都對蛋白質回收率有極其顯著的影響。

貽貝蛋白的蛋白質回收率方程為：Y＝273.205 833＋49.206 667X1＋28.054 167X2＋6.235 500X3－0.385 472X4－4.907 500X12－2.425 000X2X1－34.703 125X22＋0.145 500X3X1＋0.300 000X3X2－0.059 375X32－0.011 250X4X1＋0.051 250X4X2－0.006 325X4X3－0.001 517X42。

方程的顯著性分析的F1＝17.777 0，相應的P值為0.000 0，失擬性檢驗分析的F2＝1.118 0，相應的P＝0.426 0。由方程的顯著性檢驗可知，該方程的模型達到極顯著；失擬性分析表明，該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實測值能較好地擬合。

2.5 響應面分析及提取條件的優化

由圖7，8可知，等高線都為橢圓形，說明pH值和溫度以及溫度和加酶量兩兩之間的交互作用明顯，都對蛋白質的回收率有影響。

由圖9～12可知，貽貝蛋白的蛋白質回收率是先增加后降低，等高線的形狀反映出時間和加酶量，時間和pH值，時間和溫度，加酶量和pH值兩兩之間的交互作用較弱，響應面比較陡峭說明蛋白質回收率對時間、加酶量、溫度、pH值的變化敏感[11-13]。

為了進一步求得各因素的最佳條件組合，通過對模型方程的求解，得到曲面的最大值為72.2%。通過以上各圖，繪出各因素對應的三維擬合面與等高線，證實了響應面具有最大值。并且回歸方程求導[14]，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即4個主要因素的最佳水平值，轉換后得到提取的最佳條件為 X1＝6.3，X2＝0.75，X3＝42.9，X4＝184.9。最優提取條件和蛋白質回收率如表6所示。

蛋白質回收率最高時的條件：pH值、加酶量、酶解溫度和反應時間的具體值分別為6.3，0.75%，42.9 ℃，184.9min，該條件下得到的最大蛋白質回收率為72.2%。為了檢測該模型預測的可靠性，按優化條件進行驗證試驗，得到預測與試驗的偏差值為0.29%，說明響應面優化得到的試驗參數是可靠的。

表6 中性蛋白酶提取優化值及最優條件下最大蛋白質回收率

2.6 中性蛋白酶酶解前后氨基酸的變化

貽貝未加酶水解測定的氨基酸的結果為原料中氨基酸含量，經過中性蛋白酶水解后的氨基酸含量為酶解后氨基酸的回收率（表7）。

表7 中性蛋白酶酶解過程中氨基酸的變化

利用中性蛋白酶酶解貽貝，前后氨基酸的總量有所變化，有的含量上升，有的下降，這是因為貝類中的氨基酸包括蛋白質中的氨基酸和游離氨基酸，提取蛋白質產生的氨基酸和貝類本身含有的游離氨基酸混合在一起，所以會出現有的氨基酸含量增加，有的氨基酸含量減少的現象。

3 結論

利用響應面法對蛋白酶提取貽貝蛋白質回收率的關鍵因子進行優化。建立了蛋白質回收率與4個關鍵因子（pH值、加酶量、溫度和時間）的二次多項回歸模型，經過驗證是合理可靠的。同時利用響應面對關鍵因子及其相互作用進行了分析，得出酶解條件是pH值為6.3，加酶量為0.75%，酶解溫度42.9℃和184.9min的酶解時間時，貽貝蛋白的最大蛋白質回收率為72.2%。貽貝酶解前后氨基酸的總量變化了1.453%。該研究可以為有效科學地酶解貽貝蛋白提供重要的技術基礎。

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