高效毛細管電泳法測定清胃黃連丸中鹽酸小檗堿含量

黃玉芝，房娟娟，李 金，閆 濱

(山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355)

清胃黃連丸由黃連、石膏、桔梗、甘草、知母、玄參、地黃、牡丹皮、天花粉、連翹、梔子、黃柏、黃芩、赤芍14味中藥組方，功能清胃瀉火、解毒消腫，用于肺胃火盛所致的口舌生瘡、齒齦腫痛、咽喉腫痛[1]。鹽酸小檗堿是方中藥材的主要抗菌消炎成分，藥典中采用薄層色譜法測定其含量[1]，文獻[2]中采用反相高效液相色譜(RPHPLC)法測定。高效毛細管電泳(HPCE)法以其柱效高、分離速度快、樣品量小、儀器簡單等優(yōu)點已在藥品檢驗及質(zhì)量控制等方面得到了廣泛應用和較快發(fā)展。為此，筆者采用高效毛細管電泳法測定清胃黃連丸中鹽酸小檗堿的含量，報道如下。

1 儀器與試藥

P/ACE System 5500型高效毛細管電泳儀(美國Beckman公司);P/ACE UV Absorbance Detector檢測器，未涂敷熔融毛細管柱(47 cm×75 μm，河北永年光導纖維廠)。鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110713－200609);清胃黃連丸(水丸，批號091009，購于山東孔圣堂制藥有限公司);甲醇為色譜純試劑，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 電泳操作條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用熔融毛細管柱(47 cm×75 μm)，有效長度40 cm;60 mmol/L磷酸緩沖溶液－甲醇(65∶35)，pH=3.0;紫外檢測波長200 nm;壓力進樣138 kPa×5 s;分離電壓30 kV;柱溫25℃。每天開機后先用0.1 mmol/L的氫氧化鈉沖洗5 min，再用純水沖洗5 min，最后用背景緩沖液沖洗5 min，再開始操作。每次進樣前后用背景緩沖液沖洗1 min，所用緩沖溶液超聲處理后以0.45 μm微孔濾膜濾過。在此條件下，色譜圖見圖1。

2.2 溶液配制

精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 g的對照品溶液。取清胃黃連丸9 g，研碎混勻，精密稱取3 g，用鹽酸－甲醇(1∶100)定容至100 mL，稱定質(zhì)量，室溫放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)45 min后，放冷用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按處方工藝制備不含黃連的空白樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察:精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，分別置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至刻度，得不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為 Y=34 301 X－1 235，r=0.999 7。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在0.05～0.45 g/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:取質(zhì)量濃度為0.45 g/L的對照品溶液，連續(xù)進樣5次。結(jié)果的 RSD為1.59%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液20 mL，濃縮至1 mL，置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至10 mL，室溫下放置，每隔1 h進樣。結(jié)果的 RSD為2.3%(n=5)，表明供試品溶液中鹽酸小檗堿含量在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重現(xiàn)性試驗:取批號為091009的樣品，依法制備供試品溶液，重復6次，在上述色譜條件下測定樣品含量。結(jié)果的 RSD=0.259%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品，加入對照品適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，取20 mL，濃縮至1 mL，置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至10 mL，按優(yōu)化的色譜條件進樣分析，測定鹽酸小檗堿含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(n=5)

2.4 樣品含量測定

取2.2項下供試品溶液，濃縮至1 mL，置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至刻度，按優(yōu)化的色譜條件進樣分析。結(jié)果樣品中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果為標示量的0.34%(n=3)。因此，規(guī)定本品每1 g含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿(C20H18ClNO4)計，不得少于 3.4 mg。

3 討論

目前常用的鹽酸小檗堿定量方法有薄層色譜法[1]、紫外分光光度法[3]和高效液相色譜法[1]、高效毛細管電泳法等[4]。若試驗樣品成分復雜，前兩種方法的背景干擾大，重現(xiàn)性差[5]，存在系統(tǒng)誤差而定量不準，分離效率低。高效液相色譜法是目前最常用的方法，但用于測定鹽酸小檗堿時要實現(xiàn)良好的分離效果還存在一定難度;由于鹽酸小檗堿為季銨類生物堿，堿性強極性大，往往被色譜填料吸附，易造成色譜峰峰形不對稱、拖尾，通過改變流動相介質(zhì)可以得到一定的改善，但對色譜柱的污染大，會降低其使用壽命[6]。高效毛細管電泳法可供分析帶有一定電荷的物質(zhì)，而生物堿含有的氮原子上的孤電子對能接受質(zhì)子而顯堿性，常攜帶正電荷，因此十分適用[7]，且開管柱容易清洗而不存在污染問題。采用高效毛細管電泳法測定清胃黃連丸中鹽酸小檗堿的含量，方法學考察顯示，方法簡便易行、準確可靠，可作為樣品的質(zhì)量控制方法。

鹽酸小檗堿為季銨類生物堿，磷酸氫二鈉作緩沖液可使其保持帶有的正電荷。曾用50 mmol/L的硼砂－甲醇(85∶15)作緩沖液對黃連藥材進行預試驗，分離效果很好，但在測定清胃黃連丸中的鹽酸小檗堿時卻未能達到基線分離。也曾嘗試過以40 mmol/L硼砂－甲醇(85∶15)作緩沖液，未取得理想效果，不能實現(xiàn)基線分離。后選用60 mmol/L磷酸二氫鈉－甲醇(65∶35)作緩沖液，分離效果良好。

由于電滲流(EOF)對pH的強依賴性，導致出峰時間也對pH呈強依賴性，因此緩沖溶液的pH成為影響重現(xiàn)性的關(guān)鍵參數(shù);同時由于離子的電泳淌度直接正比于其有效電荷，而離子的有效電荷受操作中緩沖溶液pH影響，故緩沖溶液的調(diào)節(jié)與控制是優(yōu)化分離的重要對策[6]。在采用硼砂－甲醇(85∶15)緩沖體系時，pH在9.0左右，出峰時間短，但未能達到基線分離。改用磷酸二氫鈉緩沖體系后(調(diào)pH至3.0左右)出峰時間在5 min左右，而且有良好的分離效果。

黃連中含有的多種生物堿本身已帶有1個正電荷，因其結(jié)構(gòu)差異不大，故需要在選擇的緩沖液中加入適當?shù)挠袡C改性劑，以降低緩沖液濃度，從而降低離子強度，抑制電滲流，并減少毛細管壁對陽離子的吸附，得到良好的分離效果。本試驗中通過加入一定比例的甲醇，實現(xiàn)了良好的分離。

改變毛細管柱長可用來改變出峰時間。一般來說，待測成分的出峰時間要控制在15 min以內(nèi)。試驗中曾選定40，50，60 cm長的毛細管，40 cm柱長時出峰時間在5 min左右且有良好的峰形和分離度，后兩者雖具有更好的峰形和分離度，但出峰時間明顯延長。

綜上所述，在目前分析黃連藥材及其復方制劑較常用的幾種方法中，高效毛細管電泳法分離效率高，樣品需要量極少，使用簡單少量的緩沖液，幾乎不產(chǎn)生廢液，分析耗費低，樣品預處理簡單，尤其適合于分析基質(zhì)比較復雜、結(jié)構(gòu)近似的藥用植物成分。高效毛細管電泳法既可結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)建立復方藥物的指紋圖譜，又可進行多種有效成分或指標成分的定量，還可用于體內(nèi)藥物分析、開展有效成分研究。雖然高效毛細管電泳法在重現(xiàn)性和檢測靈敏度方面尚不及高效液相色譜法，但通過采用相對遷移值與疊加對比法或內(nèi)標法可以克服重現(xiàn)性差的弱點。因此，采用高效毛細管電泳法分離分析藥用植物成分，具有極廣闊的發(fā)展前景。

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