液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測硫酸多黏菌素B中各組分

劉孟娟，周陳西，胡方劍

(1.浙江省腫瘤醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310022; 2.杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310022)

硫酸多黏菌素B為快速殺菌劑，美國傳染病協(xié)會(IDSA)重點指出的“超級瘋狂菌”銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌，對其的耐藥率不高[1]。其靜脈滴注可治療由多藥耐藥革蘭陰性菌引起的嚴(yán)重感染，但因其有較嚴(yán)重的腎臟毒性和神經(jīng)系統(tǒng)毒性而一度被棄用。近年來，多藥耐藥革蘭陰性菌感染廣泛流行，多黏菌素作為治療的最后選擇再次被應(yīng)用于臨床。硫酸多黏菌素B系由多黏芽胞桿菌產(chǎn)生的一組多肽類抗生素，由至少4種結(jié)構(gòu)相近的成分組成，其中多黏菌素B1和B2是主要成分。第6版《歐洲藥典》(EP 6.0)[2]建立了液相色譜法鑒定硫酸多黏菌素B各組分，經(jīng)檢索，國內(nèi)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。筆者以高效液相色譜法以及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測硫酸多黏菌素B的各個組分，報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent);ZMD型質(zhì)譜檢測器;(Waters公司)Masslynx工作站。多黏菌素B(杭州中美華東制藥有限公司，批號為100502);多黏菌素B對照品(歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品);甲醇、乙腈及其他試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

2.1.1 高效液相色譜條件(EP 6.0)

色譜柱:末端封尾 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動相:硫酸鈉緩沖液(取4.46 g無水硫酸鈉加入900 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)到pH=2.3，再用水定容到1 000 mL)－乙腈(80∶20);檢測波長:215 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣質(zhì)量濃度:0.5 g/L;進(jìn)樣體積:20 μL。

2.1.2 液質(zhì)聯(lián)用色譜、質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18柱(300 ?，150 mm ×2.1 mm，4 μm);流動相:乙腈－0.01 mol/L三氟乙酸溶液(80∶20);稀釋液:乙腈－水(20∶80);柱溫:30℃;質(zhì)譜檢測器中流速:0.25 mL/min;進(jìn)樣質(zhì)量濃度:0.5 g/L;進(jìn)樣體積:20 μL。電噴霧電離源(ESI)，正離子檢測，電離電壓:310 kV;電噴霧接口干燥氣(N2)流速:280 L/h，離子源溫度:250℃;錐孔電壓:30 V;脫溶劑氣溫度:115℃。

2.2 溶液制備

精密稱取多黏菌素B對照品5 mg，置50 mL量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得對照品溶液。精密稱取樣品5 mg，置50 mL量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 高效液相色譜法檢測結(jié)果

多黏菌素B主要含有4個組分，分別為多黏菌素B1，B2，B3和B1－I。其主要成分為多黏菌素B1，保留時間為34 min;相對保留時間0.47的為多黏菌素B2，相對保留時間0.54的為多黏菌素，相對保留時間0.8的為B1－I。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 液質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果

高效液相色譜法的流動相中加入了大量非揮發(fā)性緩沖鹽，而液質(zhì)聯(lián)用要求流動相不能含有此類鹽，故不能直接采用同一流動相。參照文獻(xiàn)[2]，采用無鹽系統(tǒng)進(jìn)行測定，建立了適用于多黏菌素B的液質(zhì)聯(lián)用方法。詳見圖2和圖3。

圖2 液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

圖3 液質(zhì)聯(lián)用各組分陽離子圖

2.5 結(jié)果分析

多黏菌素B中4個主要組分的分子結(jié)構(gòu)式為:

相對分子質(zhì)量(M)等信息見表1。

表1 多黏菌素B主要組分信息

由于其為多肽類物質(zhì)，因此在進(jìn)入質(zhì)譜檢測器時帶兩個電荷，所以得到的陽離子檢測結(jié)果約為相對分子質(zhì)量的1/2。其中對照品主要成分的相對分子質(zhì)量為602.6×2－2=1 204，樣品主要成分的相對分子質(zhì)量也一樣，均與第6版《歐洲藥典》給出的最大組分多黏菌素B1分子質(zhì)量一致，故樣品的主要成分為多黏菌素B1。由于多黏菌素B1－Ⅰ的相對分子質(zhì)量也為1 204，其在高效液相色譜圖中相對保留時間為0.80;檢測得相對保留時間為0.47和0.54的兩個物質(zhì)相對分子質(zhì)量同為1 190，參照第6版《歐洲藥典》和文獻(xiàn)[2]可知，多黏菌素B2比多黏菌素B3先出峰，故相對保留時間為0.47的物質(zhì)為多黏菌素B2，相對保留時間為0.54的物質(zhì)為多黏菌素B3。綜上，樣品各個組分分析結(jié)果見圖4。

圖4 樣品各組分分析結(jié)果圖

3 討論

多組分抗生素中各組分含有相同的母核，僅是取代基有所不同，因此具有相同的質(zhì)譜裂解規(guī)律。利用液質(zhì)聯(lián)用所測得的有關(guān)相對分子質(zhì)量以及碎片峰的信息，結(jié)合色譜保留行為，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地對組分結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，適用于多組分抗生素的組分分析[3]。因此，該項技術(shù)為硫酸多黏菌素B的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

[1]周穎杰，施耀國.多粘菌素B治療耐多藥病原菌研究進(jìn)展[J].國際藥學(xué)研究雜志，2008，35(4);292－294.

[2]Characterization of Polypeptide Antibiotics of the Polymyxin Series by Liquid Chromatograohy Electrospray Ionization Ion Trap Tandem Mass Spectrometry[J].Journal of Peptide Science，2002，7:45 － 55.

[3]胡 敏，胡昌勤.LC－MS分析乙酰吉他霉素組分及水解產(chǎn)物[J].藥學(xué)學(xué)報，2006，41(5):476－480.