氯化鋰－紫外－離子束復合誘變紅霉素高產菌株研究

虞 龍，張 宇，龔文靜，安 肖，徐 翔

（1.南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009；2.中國獸醫藥品監察所，北京 100081）

紅霉素是1952年問世的第1個由放線菌產生的14元環大環內酯類抗生素，抗菌譜與青霉素相似，主要是對革蘭氏陽性菌如金葡菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌及梭形芽胞桿菌等有強大的抗菌作用［1］。雖然現今抗菌藥物越來越多，紅霉素在治療領域仍占有自己的地位。尤其是半合成紅霉素衍生物的開發成功如阿齊霉素、甲紅霉素、地紅霉素、羅紅霉素、氟紅霉素等，使得大環內酯類抗生素在未來的抗感染藥物中所擁有的市場份額進一步提升和擴大。

在幾種可行易操作的誘變方法中，紫外誘變可使DNA分子形成嘧啶二聚體，即兩個相鄰的嘧啶共價連接；氯化鋰誘變可導致AT－GC堿基對的轉換或導致堿基的缺失；離子束誘變是利用正電荷低能離子束注入生物體引起遺傳物質的可遺傳性改變。離子束對生物體有能量沉積、動量傳遞、粒子注入和電荷交換等4個原初反應過程［2］，生物體從而產生DNA分子斷裂、堿基缺失等物理損傷、自由基化學損傷等多種生物學效應［3］。復合誘變包括兩種或多種誘變劑的先后使用、同一種誘變劑的重復作用和兩種或多種誘變劑的同時使用。普遍認為［4］，復合誘變具有協同效應，兩種或兩種以上誘變劑合理搭配進行復合誘變較單一誘變效果好。

本文將紫外－氯化鋰－離子束結合起來對紅霉素生產菌——紅色鏈霉菌進行復合誘變。

1 材料與方法

1.1 菌種

紅色鏈霉菌，實驗室保存。

1.2 培養基

斜面／平板培養基：蛋白胨1.0%，玉米漿1.0%，淀 粉 1.0%，硫 酸 銨 0.3%，氯 化 鈉0.3%，碳酸鈣0.25%，瓊脂1.5%，pH＝6.5。

氯化鋰平板培養基：平板培養基加上一定濃度的氯化鋰。

種子培養基：淀粉3.5%，硫酸銨0.75%，氯化鈉0.5%，蛋白胨0.5%，糊精2.0%，葡萄糖3.0%，酵母粉2.0%，碳酸鈣0.8%，硫酸鎂0.05%，磷 酸 氫 二 鉀 0.08%，豆 油 0.2mL／25mL，pH＝6.5。

發酵培養基：淀粉3.0%，硫酸銨0.5%，葡萄糖2.0%，玉米漿0.1%，碳酸鈣0.9%，豆油0.3mL／25mL，pH＝6.5。

1.3 培養條件

斜面／平板培養：用無菌操作將孢子懸浮液接于斜面／平板培養基上，置37℃恒溫室中培養6～7d。

種子培養：在250mL三角瓶內裝50mL種子培養基，接種量為10%，于33℃下培養72h，搖床轉速為220r／min。

發酵培養：搖瓶為500mL三角瓶，裝液量50%，接種量10%，于33℃下培養7d，搖床轉速為220r／min。

1.4 誘變及篩選方法

1.4.1 單孢子懸浮液制備 成熟的新鮮斜面加無菌水10mL，刮洗下培養好的新鮮斜面孢子后傾于帶有一定玻璃珠的250mL三角瓶內振搖 20min（250r／min），取出過濾成菌懸液［5］，備用。

1.4.2 氯化鋰處理 取0.2mL菌懸液均勻涂布于不同濃度（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%）的氯化鋰平板培養基上，同條件下無氯化鋰的平板培養基為對照樣。

1.4.3 紫外誘變處理 取0.2mL菌懸液均勻涂布于生長平板培養基上，先開啟20W紫外燈，預熱20min，再將培養皿放在紫外燈下30cm 處，打開平皿蓋，照射30、60、90、120、150、180s，同條件下不進行照射的為對照樣。

1.4.4 離子束誘變處理 取0.1mL菌懸液均勻涂布于無菌平皿上，以無菌風吹干。鏡檢無細胞重疊者進行離子注入。注入能量為10keV，注量（×1014）為50、100、150、200、250、300cm－2，靶室真空度為10－3Pa。將平皿置于靶臺上，以10s脈沖式注入，間隔50s，以降低溫度效應的影響，靶室內放置不接受照射的對照樣。離子注入后，取出平皿，以1mL無菌水洗脫，涂平板培養基。

1.4.5 氯化鋰－紫外－離子束復合誘變 將菌懸液先涂布于含有一定濃度氯化鋰的平板培養基上，經紫外燈照射一定時間后進行培養，待其成熟制作成菌懸液進行離子注入，注入后再將其涂布于氯化鋰平板培養基上；以相同的操作，取未經氯化鋰、紫外線、離子束處理的菌懸液稀釋涂布平板為對照樣。

1.4.6 篩選方法 從培養成熟的平板菌落中挑選正常型菌落接斜面，待生長成熟后按10%接種量接入搖瓶進行培養。

1.4.7 存活率和正突變率計算 菌株的存活率為其誘變后在平板培養基上生長的菌落數與同條件下未經誘變的對照菌株在平板培養基上生長的菌落數的比值。正突變率為效價與對照菌株相比提高在5%以上的菌株占全部被考察菌株的比例。

1.5 分析方法

1.5.1 pH測定 取搖瓶發酵液過濾后用上海雷磁pHS－3B型精密pH計測量。

1.5.2 殘糖測定 發酵液過濾后稀釋一定倍數，采用SBA40型生物傳感器進行測定。

1.5.3 產物液相測定 色譜柱，不銹鋼柱（內裝填 料 PLRS－S，10nm，長 250mm，內 徑4.6mm，Agilent）；流動相，乙腈與0.04mol／L NH4H2PO4體積比為1∶2混合液，pH＝7.0；檢測波長，210nm；柱溫，室溫；流速，1.0mL／min；進樣量，100μL［6］。

2 結果與討論

2.1 氯化鋰劑量確定

在經氯化鋰處理后的每個劑量的平板中各挑出20個菌株進行搖瓶試驗，考察氯化鋰濃度對紅色鏈霉菌存活率和正突變率的影響，結果如圖1所示。在存活率逐漸下降的情況下，突變率呈先上升后下降的趨勢，當氯化鋰濃度為1.2%時，紅色鏈霉菌的存活率為90.15%，同時正突變率最高，為16.22%。因此，本實驗確定1.2%為最佳氯化鋰誘變劑量。

圖1 不同氯化鋰濃度下菌種的存活率和正突變率Fig.1 Survival rate and mutation rate with different concentrations of LiCl

2.2 紫外劑量確定

在經紫外照射處理后的每個劑量的平板中各挑出20個菌株進行搖瓶試驗，考察紫外輻照時間對紅色鏈霉菌存活率和正突變率的影響，結果如圖2所示。據文獻報道［4］，采用紫外線誘變，一般致死率為70%～80%時，產生正突變的幾率較高，有利于突變株的進一步篩選。由圖2可見，紫外具有較強的殺菌能力，輻照120s時，正突變率最高，達20.05%，同時存活率僅21.83%，輻照180s時幾乎無菌存活。因此，本實驗確定120s為最佳紫外誘變時間。

圖2 不同紫外照射時間下菌種的存活率和正突變率Fig.2 Survival rate and mutation rate with different time of UV

2.3 離子束注量確定

在經離子束誘變后的每個注量的平板中各挑出20個菌株進行搖瓶試驗，考察離子束注量對紅色鏈霉菌存活率和正突變率的影響，結果如圖3所示。對于10keV氮離子，離子注量小時菌株的存活率較高，注量增大存活率呈下降趨勢，但在200×1014cm－2附近，存活率有短暫回升，整個存活率曲線呈“馬鞍形”，同時正突變率也達28.73%。對于“馬鞍型”曲線形成的原因，宋道軍等［7］認為當注量較小時，存活率下降是能量沉積效應和動量傳遞效應綜合作用的結果。因小注量下低能N＋的直接作用可導致DNA的損傷，能量沉積所產生的大量自由基亦會導致DNA和生物膜等其他生物大分子的損傷，從而造成存活率下降。繼續提高注量，大量連續注入電荷的堆積會產生很強的庫侖斥力，這種庫侖斥力能對被注入細胞形成一“保護屏障”，阻礙后續注入離子對細胞的損傷，從而達到對細胞的保護作用；且大量堆積的電荷可形成一弱電場，這種電場的刺激效應可激活菌體內的各種酶，尤其是修復酶，從而提高了損傷修復的效率，存活率又有所回升。當注量繼續增大時，能量沉積和動量傳遞所造成的DNA和生物膜等其他生物大分子的嚴重損傷已超出其所具有的修復能力，聚集于細胞表面的電荷產生庫侖爆炸，使細胞失去電荷屏蔽而使存活率急劇下降。另外，在200×1014cm－2下，菌株的正突變率最高，與其對應的存活率一致，因此，本試驗確定200×1014cm－2為最佳離子束誘變注量。

圖3 不同氮離子注量下菌種的存活率和正突變率Fig.3 Survival rate and mutation rate with different ion fluences

2.4 復合誘變對菌體的影響

按上述確定的誘變條件進行氯化鋰－紫外－離子束復合誘變。取在最優條件下分別經氯化鋰、紫外、離子束與復合誘變的正突變菌株各50株進行搖瓶發酵，結果列于表1。由表1可見，復合誘變的存活率最低，但正突變率高達43.50%，效價提高幅度大的菌株所占比例最高。在3種單一誘變方式中，氯化鋰誘變的存活率最高，但效價提高10%以上的菌株比例不高；紫外誘變的存活率最低，菌株提高幅度也不大；經離子束誘變的菌株存活率雖不高，但正突變率最高，且菌株產量提高幅度高于其他兩種誘變方式。可見，如果要使用單一誘變方式，可選擇用離子束進行誘變。由多次復合誘變篩選到1株高產菌株，命名為E0317－1－7－26。

2.5 高產菌株分離穩定性考察

將高產菌株 E0317－1－7－26作為出發菌株，分離3代，進行產量測定，考察其分離穩定性，結果示于圖4。由圖4可見，每代的產量提高幅度均呈下降趨勢，但第3代產生回復性趨勢。結果表明，經3代分離后，菌體不但穩定性增強，而且產量也有穩定性提高。

表1 誘變結果Table 1 Result of mutation

圖4 菌體的效價提高范圍Fig.4 Increasing range of high－producing strain titer

2.6 高產菌株遺傳穩定性考察

將出發菌株和高產菌株 E0317－1－7－26各傳代5次，每代3個平行樣，發酵完進行產量測定，取3個樣的平均值，考察高產菌株遺傳穩定性，結果列于表2，其中F1～F5分別表示第1至第5代。由表2可知，高產菌株E0317－1－7－26經傳代5次后，效價略有下降，F2雖下降幅度較大，但F3效價回復性提高，然后逐漸穩定。平均效價達7 093μg／mL。

表2 高產菌株的遺傳穩定性考察結果Table 2 Inheritance stability of high－producing strain

3 結論

以上實驗結果表明，不同誘變方式對紅色鏈霉菌產生了不同的生物效應，單獨使用一種誘變方式可獲得突變菌株，但幾率很低。某一菌株長期使用誘變劑后，會對誘變劑產生“鈍化效應”。因此，目前在實驗中多采用幾種誘變劑復合處理、交叉使用的方法進行菌種選育。相關資料［8］也表明，復合誘變較單誘變劑處理后的效果好，通常是物理誘變復合化學誘變。在誘變育種中，誘變劑的選擇較為重要，選擇較合適的誘變劑會大幅減少工作量。

由表1可看出，復合誘變能在很大程度上獲得高產菌株，紫外和離子束誘變過的菌株經氯化鋰作用，其提高的抗生素效價能夠保持穩定，這可能與氯化鋰能夠抑制菌體的自我修復有關。經紫外和離子束誘變過的存活孢子經氯化鋰作用，有“提高突變‘易出誤差’修復”的作用［9］，即氯化鋰可穩定紫外和離子束所引起的遺傳物質的改變。但不是所有的誘變劑都對所選的菌株產生相同的誘變效應，菌株本身對不同的誘變劑的抵抗能力不同。在這3種誘變方式中，對紅色鏈霉菌而言，離子束作為單因素誘變效果最好（圖3）。總之，本實驗結果證實了在紅色鏈霉菌育種中，復合誘變優于單因素誘變，篩選到目的菌株的概率相對較大。

本文研究了利用氯化鋰、紫外和離子束復合誘變選育紅霉素生產菌——紅色鏈霉菌，比較了3種誘變方式的不同誘變結果，由此確定氯化鋰的最優誘變濃度為1.2%，紫外的最優誘變時間為120s，離子束的最優誘變注量為200×1014cm－2。再將3種最優誘變條件組合，用復合誘變方法篩選到1株高產菌株E0317－1－7－26。與出發菌株相比，高產突變菌株發酵生產紅霉素的能力從5 923μg／mL提高到7 126μg／mL，且遺傳性能穩定，為實現紅霉素的產業化生產提供了保證。另外，該方法可快速有效地獲得較理想的抗生素高產穩產優良菌株，拓寬了它在制藥生物工程中的應用前景，為今后微生物誘變選育打下了堅實的基礎。

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