黃瓜灰霉病菌對多菌靈、速克靈及乙霉威的抗性檢測

王美琴，趙曉軍，張 鑫，周建波，楊外芬，劉福生

（1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，山西太原030032）

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）侵染引發(fā)的灰霉病是黃瓜生產(chǎn)上的重要病害，在露地、保護地均有發(fā)生，給黃瓜生產(chǎn)造成了嚴重損失。由于灰霉病菌具有繁殖速率高、遺傳變異大和適合度高的特性[1-2]，多年連續(xù)大量使用化學藥劑使該病原菌對一些殺菌劑產(chǎn)生了抗性。我國防治灰霉病的殺菌劑品種主要為苯并咪唑類的多菌靈、甲基硫菌靈，二甲酰亞胺類的速克靈、異菌脲以及N-苯氨基甲酸酯類的乙霉威[3]。

國內(nèi)外已有灰霉病菌對多種殺菌劑產(chǎn)生抗性，甚至多重抗藥性的報道[4-6]。山西省各地近年來該病害在黃瓜上的發(fā)生與為害日趨嚴重，常用殺菌劑的田間防治效果下降。張永杰等[7-9]已報道了山西省灰霉病菌對多菌靈、速克靈及乙霉威的抗性，其中，晉中地區(qū)對這3種殺菌劑的抗性頻率分別為86%，30.3%和26%。

為了解近幾年山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對多菌靈、乙霉威及速克靈的抗性頻率和抗性水平的發(fā)展情況，本研究從山西太谷、祁縣和平遙3地的黃瓜病果上分離純化到30個灰霉病菌菌株，并測定了其對這3種殺菌劑的抗性頻率和抗性水平，旨在為生產(chǎn)上合理用藥提供一定的理論指導。

1 材料和方法

1.1 供試殺菌劑

98%多菌靈原粉和96%乙霉威原粉（均由上海新農(nóng)藥業(yè)公司生產(chǎn)）；97.8%速克靈原粉（由浙江禾益農(nóng)化有限公司生產(chǎn)）。

1.2 菌株的采集與分離

2009年3月，于山西太谷（田豐村和里秀村）、祁縣（東觀鎮(zhèn)和九級村）和平遙（王家莊）3地的保護地采集黃瓜灰霉病病果30個，并采用組織分離法進行分離[10]，切取病果內(nèi)病健交界處小塊組織，移在PDA平板中央，待長出菌絲時，取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接到另一個平板上進行純化，顯微鏡下觀察是否得到純化的菌種。

1.3 含藥培養(yǎng)基制備

98%多菌靈原藥是用0.1 mol/L稀HCl配成1 000 μg/mL母液，加入2～3滴0.2%的乳化劑Tween 80；96%乙霉威和97.8%速克靈原粉是用丙酮配成1 000 μg/mL母液，以0.2%的量加入乳化劑Tween 80。母液在4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?，用時以無菌水稀釋至所需的濃度，以1∶10的比例將藥液加入到融化的PDA培養(yǎng)基中充分搖勻，制成含藥平板。

1.4 抗藥性頻率測定

其測定采用最低抑制濃度法（MIC），鑒別濃度用Yarden標準[11]，乙霉威和多菌靈以0.5 μg/mL作鑒別濃度，速克靈的鑒別濃度為1.0 μg/mL。用直徑為0.4 cm的打孔器在培養(yǎng)2 d的待測菌株邊緣取菌塊接種于含鑒別濃度的PDA平板上，每個處理重復3次，放在22～23℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察、記錄菌株生長情況。在鑒別濃度上正常生長的菌株為抗性菌株。

1.5 抗藥性水平測定

其測定采用FAO推薦的菌落直徑法[12]，取1.4鑒別出的敏感菌株3個和抗性菌株6個作為待測菌株，用直徑為0.4 cm的打孔器在待測菌株菌落邊緣取菌塊，接種于一系列質(zhì)量濃度的含藥平板上。乙霉威敏感菌株的測試質(zhì)量濃度依次為0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 μg/mL，抗性菌株為 1.0，1.5，2.0，2.5，5.0，10.0 μg/mL；多菌靈敏感菌株為 0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 μg/mL，抗性菌株為 5，10，20，50 ，100 μg/mL；速克靈敏感菌株為 0.05，0.1，0.25，0.5，0.75 μg/mL，抗性菌株為5.0，10.0，15.0，20.0，50.0 μg/mL。以不加藥劑為對照，每個處理重復3次。置于22～23℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，測量菌落直徑。根據(jù)菌落在不同濃度藥劑平板上的生長抑制率，用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

抗性水平＝抗性菌株EC50/感菌株EC50

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征

用組織分離法獲得14個采自山西省太谷縣的黃瓜病果灰霉菌株，編號為Tg1～Tg14；8個采自祁縣，編號為 Qx1～Qx8；8個采自平遙，編號為Py1～Py8。初期菌絲呈灰色，并逐漸加深，變灰褐色，在PDA平板上生長速度較快，48～72 h均可長滿直徑為9 cm的平板。15 d后在平板上形成黑色、片狀或不規(guī)則的小型菌核。通過鏡檢觀察，病菌的分生孢子梗較長，多數(shù)叢生，直立，褐色，有隔，頂端具1～2次分支；分支頂端膨大呈頭狀，其上密生小柄，產(chǎn)生大量分生孢子，如同葡萄穗；分生孢子球形至卵球形，無色，單胞，表面光滑。

2.2 灰霉病菌對3種殺菌劑的抗性頻率

通過MIC法對分離到的30個灰霉菌株進行室內(nèi)測定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，乙霉威的抗性菌株21個，敏感菌株9個，抗性頻率為70%；多菌靈的抗性菌株24個，敏感菌株6個，抗性頻率為80%；速克靈的抗性菌株27個，敏感菌株3個，抗性頻率為90%。

2.3 灰霉病菌敏感菌株對3種殺菌劑毒力測定

表1結(jié)果表明，乙霉威敏感菌株的平均EC50為0.036 9 μg/mL，多菌靈敏感菌株的平均EC50為0.057 4 μg/mL，速克靈敏感菌株的平均EC50為 0.269 2 μg/mL。

表1 灰霉病菌敏感菌株對乙霉威、多菌靈和速克靈的EC50

2.4 灰霉病菌的抗性菌株對3種殺菌劑的抗性水平

表2結(jié)果表明，乙霉威6個抗性菌株的EC50在2～3 μg/mL之間，平均抗性倍數(shù)為66.0倍，說明山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對乙霉威的抗性達到中抗。多菌靈抗性菌株的EC50在22～27 μg/mL之間，平均抗性倍數(shù)為421.5倍，說明山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對多菌靈的抗性達到高抗；速克靈抗性菌株的EC50在11～19 μg/mL之間，平均抗性倍數(shù)為53.3倍，說明山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對速克靈的抗性為中抗。

表2 灰霉病菌抗性菌株對乙霉威、多菌靈和速克靈的抗性水平

3 結(jié)論與討論

2003年報道的有關(guān)山西省晉中地區(qū)灰霉病菌對多菌靈、速克靈和乙霉威的抗性頻率分別為86%，30.3%和26%[7-9]，本試驗測定的黃瓜灰霉病菌對這3種殺菌劑的抗性頻率分別為80%，90%和70%，速克靈和乙霉威的抗性頻率均大幅度增加，而多菌靈卻略有下降。分析其原因認為，當時在許多地區(qū)灰霉病菌對多菌靈已經(jīng)達到高抗，防效降低，以至多菌靈在生產(chǎn)中已經(jīng)停止使用，病原菌對其的敏感性有所下降，而速克靈和乙霉威仍然是防治灰霉病的常用藥劑，所以其抗性頻率大幅度增加，但其抗性程度集中在中抗水平。建議在生產(chǎn)中要減少速克靈和乙霉威的用藥量或者與其他殺菌劑科學合理地混合使用，以延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長藥劑的使用年限。

近年來，對于灰霉病的防治方法，除了使用化學藥劑外，許多科技工作者也嘗試使用其他的防治方法，如生物防治，篩選拮抗菌株[12-13]，或者用人工嫁接的方法來降低病害的發(fā)生等[14]。

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