白藜蘆醇對小鼠移植宮頸癌的抑制作用及機制研究

胡可可 譚琛 張琴 陳曉瓊 鄧赫男 肖斌梅

郴州市第一人民醫院婦產科，湖南 郴州 423000

宮頸癌是危害婦女生命及降低婦女生活質量的主要疾病之一，發展中國家發病率高于發達國家，農村高于城市。在我國，宮頸癌發病率占婦女惡性腫瘤之首，約占女性生殖器惡性腫瘤的72.4 %～93.1%。影響中國已婚婦女宮頸癌發生的主要危險因素是：人類乳頭瘤病毒感染、人工流產次數、性伴侶、被動吸煙及丈夫包皮過長等［1］。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的非黃酮多酚類化合物，化學名稱為反式-3,4,5-三羥基-1,2-二苯乙烯，分子式C12H14O3，具有抗氧化、抗炎、 雌激素樣活性、生長抑制、免疫調節、化學預防以及抗腫瘤等多種生物活性［2］。新近研究發現，Res在細胞水平可通過誘導細胞凋亡、影響信號傳導通路等多途徑抑制宮頸癌細胞的生長［3］，但體內水平研究尚未見報道。615近交系小鼠宮頸癌U14在移植同系小鼠后具有淋巴和血道雙向轉移的特性，其生物學行為與臨床宮頸癌患者相似［4］。因此，本實驗利用該小鼠宮頸癌動物模型，研究Res對宮頸癌細胞增殖的影響，并初步探討其抗癌機制。

1 材料和方法

1.1 藥品與主要試劑

Res購于美國Sigma公司，順鉑注射液購自江蘇豪森藥業股份有限公司。TRIzol試劑、SuperscriptⅡ逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒購于美國Invitrogen公司，PCR Marker購于上海鼎國生物公司，引物由上海生工生物工程公司合成。BCA 蛋白定量測定試劑購自Hyclone-Pierce公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒以及SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)兔抗鼠一抗購于美國Santa Cruz公司。CD34兔抗鼠一抗、DAB顯色劑均購自福州邁新生物工程公司。

1.2 動物及腫瘤細胞株

615 近交系小鼠40只，6周齡，雌性，體重(20.0±2.0) g，購自中國醫學科學院協和醫科大學實驗動物中心，并在SPF級環境下飼養。小鼠宮頸癌U14瘤細胞株由中國醫學科學院腫瘤研究所提供，經常規復蘇后，接種于615近交系小鼠腹腔傳代。當小鼠腹水呈乳白色時，采集腹水并用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成5×107/mL瘤細胞懸液備用。

1.3 模型制備與分組給藥

40只615 近交系小鼠均于右側背部皮下注射瘤細胞1×107個/只(0.2 mL)，每天觀察小鼠及局部成瘤情況，腫瘤直徑≥2.0 mm時為成瘤。皮下接種腫瘤后第6天，40只小鼠皮下移植處均成瘤，將小鼠隨機分成4組：對照組、Res低劑量組、Res高劑量組、順鉑組，每組10只。根據預實驗的結果，將Res低、高劑量組中每天每只小鼠Res的量定為2.5、10 mg/kg，并溶解于0.1 mL 0.9%的氯化鈉溶液中，每天灌胃1次；對照組每天用同體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃；順鉑組小鼠給予3 mg/kg順鉑注射液腹腔注射，連續給藥20 d。給藥期間觀察各組小鼠的精神、反應、活動、飲食及大小便等一般情況。第26天處死全部小鼠進行指標檢測，并將腫瘤組織分為3部分，分別用于RT-PCR檢測、Western blot檢測和4%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，切片，供免疫組織化學、病理學及凋亡檢查。

1.4 抑瘤率測定

接種前和接種后每兩天稱1次體重，按體重變化調整給藥。接種后每兩天測量1次小鼠皮下腫瘤最長徑(a)和最短徑(b)，計算腫瘤體積(V= a×b2/2)。第26天頸椎脫臼處死小鼠，完整剝離腫瘤稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=(1-治療組平均瘤質量/對照組平均瘤質量)×100%。

1.5 RT-PCR檢測MIF基因表達

采用TRIzol試劑抽提腫瘤組織總RNA，獲得的RNA按SuperscriptⅡ逆轉錄試劑盒說明合cDNA，按PCR試劑盒說明書進行DNA擴增。MIF引物序列為［5］：5’-GCAAGCCCGCACAGTACA-3’和5’-CGTTCGTGCCGCTAAAAGTC-3’，擴增產物長度468 bp；內參照基因β-actin引物序列為：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3’和5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3’，擴增產物長度198 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃ 60 s、56 ℃ 30 s、72 ℃60 s進行35個循環，最后72 ℃延伸 7 min。在1.5%含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果，以PCR Marker作為標準分子量參照進行產物鑒定。用Total lab分析軟件進行條帶掃描分析，測量電泳條帶密度，計算MIF mRNA相對量。MIF mRNA相對量＝MIF產物電泳條帶密度/β-actin產物電泳條帶密度。

1.6 Western blot檢測MIF蛋白表達

將腫瘤組織放入液氮碾磨，三去污裂解液裂解。BCA 法測定蛋白濃度，50 μg蛋白與加樣緩沖液混合，在10%不連續十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中電泳分離，電轉移至PVDF膜，溫育一抗、二抗，以β-actin為內參照，用ECL發光法顯色，曝光、顯影、定影。膠片條帶用薄層掃描儀進行掃描后，運用Imager2200軟件分析各產物積分光密度值，計算MIF 蛋白相對量。MIF蛋白相對量=MIF積分光密度值/β-actin積分光密度值。

1.7 HE及免疫組織化學染色

取腫瘤組織，10%中性甲醛固定、石蠟包理，5 μm連續切片，HE染色，光鏡觀察。采用免疫組化SABC法檢測腫瘤組織微血管密度(microvessel density，MVD)的表達，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，陰性對照用PBS代替一抗。MVD的判定標準，凡與鄰近的腫瘤細胞、微血管或結締組織分開的，呈棕黃色CD34陽性染色的單個內皮細胞或內皮細胞串計為一個血管，但肌層較厚，或管腔面積大于8個紅細胞直徑的血管不計數。MVD計數參考Weidner［6］的方法，先在低倍鏡下掃視整個組織切片，在腫瘤浸潤區選擇內皮細胞染色清晰，背景良好，微血管最密集的4個視野，然后在高倍鏡視野范圍內計數所有染色的微血管，取4個視野的計數結果均數為該切片的微血管數。

1.8 腫瘤細胞凋亡

用TUNEL原位凋亡法檢測，方法步驟嚴格按試劑盒說明書進行，同時設立陽性對照與陰性對照。細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。凋亡細胞半定量分析：在400高倍視野下，每張切片計數5個高倍視野，分別計算每個視野細胞核數及凋亡陽性細胞核數，取均值，計算凋亡指數(apoptosis index，AI)：AI(%)＝凋亡陽性的細胞核數/總計數的細胞核×100%。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 移植瘤組織病理學觀察

對照組癌細胞浸潤周圍組織呈巢狀分布，細胞形狀不規則，大小不一，核大深染，核漿比例增大，核異形性明顯，可見病理性核分裂相。各組內均可見組織壞死區，對照組相對較少。Res低、高劑量組癌細胞皺縮，核固縮或碎裂，可見凋亡細胞，順鉑組見片狀壞死的癌細胞。

2.2 Res對移植瘤生長的抑制作用

用藥期間，順鉑組小鼠逐漸出現精神萎靡不振，活動減少，食欲下降，毛發干澀脫落，消瘦等表現。其余各組一般狀況良好，未見明顯不良反應。接種瘤細胞后各組腫瘤體積均逐漸增大。治療初期，各組腫瘤生長速度相似。治療5 d后，治療組腫瘤生長速度明顯慢于對照組。在治療終點，與對照組相比，Res高劑量組和順鉑組腫瘤體積縮小，腫瘤質量明顯下降(P<0.01)，而Res低劑量組與對照組比較則差異無統計學意義(P>0.05)。Res高劑量組和順鉑組抑瘤率顯著高于Res低劑量組(P<0.01)。Res高劑量組腫瘤體積、腫瘤質量、抑瘤率與順鉑組比較差異無統計學意義(P>0.05，表1)

2.3 Res對腫瘤組織MIF表達的影響

條帶密度掃描及半定量分析顯示，Res高劑量組和順鉑組MIF mRNA和蛋白表達水平較對照組顯著降低(P<0.01)，但低劑量Res對其表達無明顯影響(P>0.05)。順鉑組MIF mRNA和蛋白表達水平明顯低于Res各劑量組(P<0.05或0.01，圖1、2)。

表1 Res對移植瘤生長的影響Tab.1 Effect of Res on transplanted tumor growth

圖1 各組腫瘤組織MIF mRNA表達Fig.1 Expression of MIF mRNA in tumor tissues among groups

圖2 各組腫瘤組織MIF 蛋白表達Fig.2 Expression of MIF protein in tumor tissues among groups

2.4 Res對腫瘤血管生長的影響

免疫組織化學染色顯示，腫瘤組織切片中，微血管密集區多位于腫瘤細胞浸潤的前緣部位，內皮細胞被染成棕黃色(圖3)。Res高劑量組和順鉑組與對照組比較，MVD明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)，但Res低劑量組與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。Res低劑量組MVD顯著高于順鉑組(P<0.01)，然而Res高劑量組和順鉑組比較差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

2.5 Res對腫瘤細胞凋亡的影響

TUNEL染色顯示，凋亡細胞明顯固縮，核致密，深染為棕黃色多葉狀或新月狀顆粒，常聚集在核周邊；未凋亡的細胞核呈藍綠色(圖4)。Res高劑量組和順鉑組AI顯著高于對照組(P<0.01)，但Res低劑量組AI與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Res低劑量組AI顯著低于順鉑組(P<0.01)，但Res高劑量組和順鉑組比較差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

圖3 各組腫瘤組織CD34表達情況Fig.3 Expression of CD34 in the tumor tissues among groups

圖4 各組腫瘤細胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of tumor cells among groups(TUNEL, ×400)

表2 各組MVD和凋亡指數比較Tab.2 Comparison of MVD and AI among groups

3 討 論

宮頸癌是較常見的婦科腫瘤，治療以手術為主術后多聯合化、放療。目前由于化療藥物多有較大不良反應，限制了臨床應用，影響了其療效，因而尋找抗瘤效果好而毒性低的藥物是一項緊迫的任務。近年來，Res抗腫瘤的效能日益受到關注，在腫瘤發生、發展中均顯示抗腫瘤功效［7］。本研究表明，Res對宮頸癌移植瘤具有顯著的抑制作用，與Res抑制其它腫瘤生長的報道一致。其機制可能與Res通過清除小蛋白 RNA 還原酶的酪氨酰基來抑制 RNA 還原酶的活性有關。Res還能抑制DNA 聚合酶，對該酶的抑制可以從根本上降低DNA 的合成能力，從而達到抑制細胞增殖的作用［8］。此外，本實驗過程中，Res各劑量組小鼠的一般情況較好，體質量增加，而順鉑組小鼠的一般情況較差，體質量減輕明顯，說明本實驗治療劑量的Res對小鼠的重要臟器無不良反應，10 mg/kg Res的抑瘤作用與3 mg/kg順鉑相當，但不良反應更小。

MIF作為經典炎癥細胞因子，不僅參與機體炎癥及免疫反應，也成為獨特的促腫瘤發生發展的細胞因子之一。近年來多項研究結果證明MIF直接影響正常細胞的分裂和癌基因誘導的惡性轉化，或間接通過調節機體免疫反應、影響細胞抑癌基因p53的功能、促進細胞增殖和遷移、促進血管生成等多個方面影響腫瘤的發生和發展，是患者預后不良的指征［9］。本研究的前期研究發現，MIF在宮頸癌組織中高表達，而且其表達水平與宮頸癌的臨床分期、病理分化程度、淋巴結轉移、瘤體大小密切相關［10］。本研究結果表明，Res高劑量組MIF mRNA和蛋白表達水平較對照組顯著降低，但低劑量Res對其表達無明顯影響，提示適當濃度的Res在體內能明顯地下調MIF的表達，從而抑制腫瘤的生長。

新生血管形成對實體腫瘤生長和轉移必不可少，MVD是反映腫瘤血管生成活性或強度的重要定量指標之一，對于血管抑制藥物的療效評價十分有用，其所選取的血管內皮細胞標記物中以CD34抗原特異性最高，重復性最好。CD34能清晰地選擇性地顯示血管內皮細胞，其它組織不著色。這就為免疫組織化學定量研究腫瘤內血管生成提供了依據。符慧群等［11］研究發現，Res通過下調血管內皮生長因子表達抑制小鼠Lewis肺癌血管生成。本實驗結果顯示，對照組MVD值最高，表明宮頸癌在生長過程中形成了豐富的新生血管，從而促進了腫瘤的生長，應用Res治療后，高劑量組MVD顯著降低，而低劑量組與對照組比較差異無統計學意義，提示Res在體內能明顯抑制腫瘤內血管形成，從而抑制宮頸癌的增殖。

細胞凋亡是基因控制下的細胞程序性死亡過程，凋亡受阻是包括腫瘤在內的多種人體疾病的重要發病機制，因此，誘導腫瘤細胞凋亡成為當今腫瘤治療的熱點。目前已有大量的實驗證明，Res對多種腫瘤細胞具有誘導凋亡作用［12］。Bhat等［13］發現Res抑制子宮內膜癌生長的途徑主要通過激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-3，接著分解DNA修復酶中的poly-A聚合酶，最終誘導其凋亡。周學武等［3］的研究也表明，Res對人宮頸癌HeLa細胞有明顯的凋亡陽性反應，且隨時間延長凋亡率增加。本研究提示，適當濃度的Res能明顯促進宮頸癌細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明，Res對小鼠宮頸癌的生長具有明顯抑制作用，并且不良反應較低，其機制主要與下調MIF表達、抑制腫瘤內微血管生成和促進腫瘤細胞凋亡有關。深入研究Res的抗癌作用，將為宮頸癌的治療帶來新的希望。

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