在非小細胞肺癌患者中甲狀旁腺激素相關蛋白PTHrP的表達及其臨床意義

龔麗明 黃云超 李鴻鈞 歐霞 王東坤

1.昆明醫學院第四附屬醫院，云南省第二人民醫院心胸外科，云南 昆明 650021；2.昆明醫學院第三附屬醫院胸心血管外科，云南 昆明 650118；3.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物研究所，云南 昆明 650118

肺癌是一常見惡性腫瘤，占癌癥相關死亡原因的首位，在環境污染及吸煙等易發因素影響下，其發病率呈上升趨勢，病理學確診的病例中以非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的發病率最高。盡管吸煙都是引起男、女性患者發生肺癌的最主要原因，但是在臨床病理特點及生存率方面男、女性患者之間仍有不同，無論處于哪一期的女性患者，其預后往往比男性患者好［1］。因此探討肺癌發病機理、發展過程及臨床預后與性別的關系十分必要。大約2/3的NSCLC表達甲狀旁腺激素相關蛋白(parathyroid hormone-related protein，PTHrP)，該蛋白在結構上與甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)相似，可導致惡性腫瘤高鈣血癥，還可改變癌細胞的增殖率、調節凋亡傾向并阻止腫瘤血管生成［2］。PTHrP的水平與性別及性激素的狀態相關［3］，有文獻報道女性肺癌患者PTHrP的水平較男性肺癌患者PTHrP的水平高，但仍缺乏PTHrP與患者生存率關系的研究。本實驗用免疫組織化學方法檢測125例NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠端正常組織中PTHrP的表達，分析其與患者性別、組織分化程度、臨床分期及預后的相關性，探討在NSCLC患者中PTHrP的表達和女性患者生存期的關系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

125 例NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠端正常肺組織來自昆明醫學院第四附屬醫院和昆明醫學院第三附屬醫院心胸外科2007年1月—2011年1月間手術切除標本，所取標本用10%甲醛固定后送病理科做組織蠟塊，男性73例，女性52例，年齡35～75歲，平均年齡54.5歲，中位年齡52歲。所有患者均行肺癌根治術，術前未經化療或放療且經過組織病理學診斷證實。按照WHO/IASLC肺上皮腫瘤組織學分類標準(1999年)進行組織學分類：鱗癌48例，腺癌65例，腺鱗癌12例；高分化癌20例，中分化癌66例，低分化癌39例。按國際抗癌聯盟(UICC，2009年第7版)TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期57例，Ⅲ期36例，Ⅳ期14例。隨訪時間從術后第1天至2011年1月16日。

1.2 試劑

抗PTHrP鼠抗人單克隆抗體(3D1.1)和UltraSensitiveTMSP試劑盒(KIT-9720)均由福州邁新生物技術開發有限公司提供。

1.3 方法

標本經10%甲醛固定，常規脫水包埋，做4 μm厚連續切片，分別進行HE染色和免疫組織化學染色(SP法)。以EDTA抗原修復液直接煮沸抗原修復法修復組織抗原，已知陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

PTHrP蛋白以細胞質染色呈棕黃色顆粒為陽性反應細胞。高倍鏡下(×400)每張切片計數200個細胞，根據陽性反應細胞所占百分比將結果分為：陰性(-)為0～＜10%；陽性(+)為10%～50%；強陽性(++)為＞50%。

1.5 統計學處理

用χ2檢驗、Fisher精確概率法和秩和檢驗比較組間差異，用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗進行生存分析，Cox比例風險回歸進行多變量生存分析。所有數據均采用SPSS 17.5統計軟件分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PTHrP在NSCLC腫瘤組織、癌旁組織、遠端正常肺組織中的表達

PTHrP在肺癌組織中陽性表達50例，強陽性表達32例，陽性率為65.6%；在癌旁組織中陽性表達19例，強陽性表達11例，陽性率為24.0%；在正常組織中陽性表達10例，強陽性表達11例，陽性率為16.8%。其中在癌旁組織及遠端正常肺組織中的表達多呈陰性，在癌組織中的表達顯著強于癌旁組織及遠端正常肺組織，3組間比較差異有統計學意義(H=70.130，P＜0.001，圖1，表1)。

表1 PTHrP在NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠端正常肺組織中的表達Tab.1 Expression of PTHrP in NSCLC cancer tissues, noncancerous adjacent lung tissues and normal lung tissues

PTHrP在NSCLC腫瘤組織的陽性表達率為65.6%，其中在腺癌、鱗癌及腺鱗癌中的陽性表達率分別為：70.8%、64.6%和41.7%，腺癌的陽性表達率較高，但組間比較差異無統計學意義(H=2.049， P=0.359)；PTHrP在癌旁組織中的陽性表達率是24.0%；在遠端正常肺組織中的陽性表達率是16.8%。三者間兩兩比較，腫瘤組織與癌旁組織的PTHrP陽性表達率差異有統計學意義(P＜0.001)；腫瘤組織與遠端正常肺組織的PTHrP陽性表達率差異有統計學意義(P＜0.001)；癌旁組織與遠端正常肺組織的PTHrP陽性表達率差異無統計學意義(P=0.201)。三者比較PTHrP陽性表達率差異有統計學意義(P＜0.001)，其中在NSCLC腫瘤組織的陽性表達率最高。

2.2 在NSCLC組織中PTHrP的表達與患者各種臨床病理因素的關系

92例65 歲以下患者中PTHrP陽性表達63例(68.5%)；33例65歲以上患者中PTHrP陽性表達19例(57.6%)，兩組間PTHrP的表達差異無統計學意義(P=0.258)。根據不同分期分組，PTHrP的表達差異無統計學意義(P=0.732)。腺癌組、鱗癌組及腺鱗癌組間比較，PTHrP的表達差異無統計學意義(P=0.147)。吸煙者與不吸煙者組間比較，PTHrP的表達差異無統計學意義(P=0.692)。男性與女性組間比較，PTHrP的表達差異有統計學意義(P=0.001)。說明PTHrP的表達與年齡、臨床分期、組織學分型和吸煙史無關，但與性別相關，女性患者中PTHrP的表達較男性患者中PTHrP的表達高(表2)。

2.3 PTHrP在NSCLC組織中的表達與患者性別的關系

如表3所示，在女性患者和男性患者中，PTHrP的表達差異有統計學意義(P=0.001)，其中女性患者的表達最高(82.7%)；Ⅰ期患者不同性別的PTHrP表達差異有統計學意義(P=0.023)，其中女性患者的表達最高(100%)，Ⅱ期患者不同性別的表達差異無統計學意義(P=0.091)，Ⅲ和Ⅳ期患者不同性別的表達差異無統計學意義(P=0.059)；腺癌組不同性別的PTHrP表達差異無統計學意義(P=0.056)，鱗癌組不同性別的表達差異有統計學意義(P=0.035)，腺鱗癌組不同性別的表達差異無統計學意義(P=0.092)；吸煙組不同性別的PTHrP表達差異無統計學意義(P=0.202)，不吸煙組不同性別的表達差異有統計學意義(P=0.001)。女性不吸煙者的陽性表達較高(80.9%)。

在所有患者、女性患者和男性患者中，PTHrP的表達在臨床Ⅰ～Ⅳ期中差異無統計學意義(P＞0.05)；在腺癌、鱗癌和腺鱗癌組中的表達差異無統計學意義(P＞0.05)；在吸煙組和不吸煙組中的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 PTHrP表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系Tab.2 The relationship between expression of PTHrP protein and NSCLC clinicopathologic factors

2.4 PTHrP在NSCLC組織中的表達與患者生存率的關系

Kaplan-Meier生存曲線顯示：在女性患者中PTHrP的表達與生存率相關(P＜0.001)，但是在男性患者中PTHrP的表達與生存率無關(圖2)。

在多變量分析中，有關吸煙史和PTHrP的表達情況均與患者的生存率相關。女性患者中，不管其是否吸煙，PTHrP表達陽性者較PTHrP表達陰性者有較長的生存期(P＜0.05)；而男性患者中，從不吸煙者較少，其PTHrP的表達與生存率無關，吸煙者PTHrP的表達與生存率無關(圖3)。

3 討 論

PTHrP與PTH氨基端部分相似，有部分相似的功能，是一種分泌蛋白，可通過減少腎臟的鈣分泌、增加骨的鈣釋放而產生高鈣血癥［4］。該蛋白在胎兒肺、成人肺和肺癌中都有表達，在胎肺的發育、正常肺的生理、肺

損傷及肺癌的病理生理方面均有作用［5］。最早在BEN肺鱗癌細胞中發現PTHrP，在55%～95%的肺癌細胞株和人類肺腫瘤中表達，約2/3的NSCLC患者表達PTHrP［6］。人類PTHrP基因位于12q29染色體，包含15個以上堿基、7個外顯子、6個內含子、3個獨立的驅動子和多個3’非編碼區域，而PTH位于11q39染色體，包含3個外顯子，通常認為這兩個染色體在進化方面有相關性，有一個共同的外顯區編碼前序列［7-8］。PTHrP通過影響細胞生長周期而改變癌細胞的增殖率、調節凋亡傾向、調節integrin的大小和基質金屬蛋白酶的表達并阻止腫瘤血管生成，這種對肺癌細胞生長的影響能夠調節腫瘤的進展、改變腫瘤的侵襲或轉移［9-11］、改變腫瘤對治療的敏感并在不同方面影響腫瘤的病理發生，從而可影響肺癌患者的生存率［12-13］。

表3 PTHrP表達與NSCLC患者性別的關系Tab.3 Demographic and lung cancer data by gender and PTHrP protein expression in NSCLC

圖2 不同性別NSCLC患者PTHrP的表達與其生存率的關系Fig.2 Kaplan-Meier survival curves for female and male patients with NSCLC as a function of tumor PTHrP A: Female; B: Male.

圖3 NSCLC患者的吸煙史、PTHrP的表達與其生存率的關系Fig.3 Survival curves for non-smokers versus smokers

大量的研究工作已經評價了PTHrP在肺癌中導致高鈣血癥的作用，但揭示其在肺癌的進展或生存預后方面的工作還很少，尤其是探討PTHrP的表達和女性肺癌患者生存優勢之間關系的工作更少。近期國外的一些研究提示在肺癌中PTHrP的表達是一個有益的預后因子，女性肺癌患者PTHrP的水平較男性肺癌患者PTHrP的水平高［3，9-10］。Hastings等［10］觀察兩株正常情況下PTHrP表達陰性的肺腺癌細胞株，轉染PTHrP后肺癌細胞的DNA合成受抑制，降低了肺癌細胞的增殖率，通過對細胞周期和分裂的影響減慢了肺癌細胞的生長。Yamada等［14］和Bhatia等［15］分別用抗PTHrP抗體治療腫瘤患者，均降低了骨轉移的發生率，增加了腫瘤細胞的凋亡。本實驗用免疫組織化學方法檢測NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠端正常肺組織中PTHrP的表達，分析其與患者臨床病理因素的相關性，比較陽性及陰性患者的生存率。研究發現約2/3的NSCLC中存在PTHrP的免疫反應，PTHrP在肺癌組織中的表達顯著高于在非癌肺組織中的表達，在女性患者中腫瘤PTHrP的表達(82.7%)高于男性患者(53.4%)。PTHrP陽性更傾向于腺癌患者，但差異無統計學意義(P=0.056)。在PTHrP陽性和PTHrP陰性的患者間，其臨床分期、組織學、吸煙史和年齡之間差異無統計學意義(P＞0.05)。生存率按患者性別分析有較大差異，男性患者中PTHrP陽性者的中位生存時間是27.14個月，PTHrP陰性者的中位生存時間是25.00個月，差異無統計學意義(P＞0.05)，說明男性患者的生存率與PTHrP狀態無關；女性患者中PTHrP陽性的中位生存時間是38.62個月，PTHrP陰性者中位生存時間是20.00個月，差異有統計學意義(P＜0.05)。用有吸煙史的所有女性患者的數據繪制的生存曲線顯示了一種傾向：PTHrP 陽性者有較長的生存期。男性吸煙患者的生存曲線不受PTHrP狀態的影響。研究結果提示：在NSCLC患者中，女性PTHrP的表達率較男性高；PTHrP陽性的女性患者比男性患者有較長的生存期；PTHrP陽性的女性患者生存期較PTHrP陰性的女性患者長。從而提示PTHrP的表達可以作為女性NSCLC患者生存優勢的一個有意義的預測指標，但PTHrP是否為影響NSCLC患者預后的獨立因子還需要下一步的研究結果來確定。

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