BALB/c小鼠感染不同瘧原蟲CD4+Th應答和凋亡特點的比較研究

鄭麗，孫曉丹，潘艷艷，馮輝，陳光，周泓旭，曹雅明*

(1.中國醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫科大學臨床醫藥學院醫學基礎教學中心，遼寧沈陽110001; 3.佳木斯大學基礎醫學院寄生蟲學教研室，黑龍江佳木斯154000)

BALB/c小鼠感染不同瘧原蟲CD4+Th應答和凋亡特點的比較研究

鄭麗1，孫曉丹2，潘艷艷1，馮輝1，陳光3，周泓旭1，曹雅明1*

(1.中國醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫科大學臨床醫藥學院醫學基礎教學中心，遼寧沈陽110001; 3.佳木斯大學基礎醫學院寄生蟲學教研室，黑龍江佳木斯154000)

探討不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠的免疫應答特點。BALB/c小鼠經腹腔注射致死型約氏瘧原蟲(P.y17XL)和夏氏瘧原蟲(P.c AS)感染的紅細胞，計數紅細胞感染率;ELISA動態檢測感染小鼠脾細胞培養上清中IFN-γ和IL-4水平;流式細胞術檢測脾中CD4+T細胞凋亡數量。約氏瘧原蟲(P.y17XL)感染早期，小鼠原蟲血癥持續上升;IFN-γ和IL-4分泌水平僅在感染后第3天出現一過性有意義的升高，而且峰值較低;脾中CD4+T細胞大量凋亡，小鼠全部死亡;而夏氏瘧原蟲(P.c AS)感染小鼠，原蟲血癥上升緩慢;IFN-γ分泌水平在感染后第5天達峰值;IL-4分泌水平在感染后第10天達峰值，且峰值較高維持時間較長;脾中CD4+T細胞凋亡細胞于感染后8 d出現有意義升高，小鼠全部存活。抗瘧保護性免疫有賴于Th1和Th2型免疫應答的有效建立和協調過渡，感染期間CD4+T細胞凋亡的時相和數量可能是影響免疫應答的強度或引起宿主免疫抑制的原因，從而影響宿主瘧原蟲感染的結局。

BLAB/c小鼠;約氏瘧原蟲;夏氏瘧原蟲;Th應答;凋亡

瘧疾是瘧原蟲經媒介按蚊傳播的嚴重威脅人類健康的寄生原蟲感染性疾病。2010年WHO報告，2009年全球瘧疾病例超過2億人，導致近百萬患者死亡［1］，給全球尤其是發展中國家帶來了沉痛的健康危害和嚴重的經濟負擔［2］。隨著瘧疾疫苗的開發和抗瘧藥物的研究進展，宿主對瘧原蟲的免疫機制的研究越來越成為人們關注的熱點。以往的研究顯示，在瘧疾感染早期Th1應答的有效建立和后期Th1向Th2應答的有序過渡是不同小鼠感染同種瘧原蟲出現治愈和死亡的原因［3］。在瘧疾感染早期，DC產生IL-12誘導IFN-γ分泌增加的Th1型細胞免疫應答，增強巨噬細胞的吞噬活性，并通過TNF-α及NOs遏制瘧原蟲的爆發性增殖;隨之，由Th2型細胞輔助B細胞產生特異性抗體，有效清除瘧原蟲，防止復發和再燃［4-6］。本研究利用成功建立的約氏瘧原蟲(P.yoelii17XL，P.y17XL)和夏氏瘧原蟲(P.chabaudi AS，P.c AS)感染的BALB/c小鼠模型，對比觀察了宿主的感染模式、Th1和Th2型免疫應答特點，特別是感染后宿主脾細胞CD4+T細胞凋亡的數量，以期為瘧疾等感染性疾病的有效控制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6～8周齡雌性BALB/c小鼠，中國醫學科學院實驗動物研究所提供，許可證編號:SCXK6京2004-0001。

1.1.2 主要試劑RPMI 1640培養基(Thermo);小牛血清(Biological Industries，Haemek，Israel); IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒(R＆D System，Minneapolis，MN);抗CD4-FITC單克隆抗體(GK1.5克隆)。Annexin-V-PE apoptosis detection kit(BD Pharmigen)。

1.1.3 主要儀器自動酶標檢測儀，Model 450，Bio-rad產品;FACSCalibur流式細胞儀，FACSean，美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 瘧原蟲及實驗動物感染6～8周齡雌性BALB/c小鼠，經腹腔分別感染1×106P.y17XL和P.c AS(日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈)寄生的紅細胞(pRBC)，感染不同時間的小鼠經尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，計數紅細胞感染率。

1.2.2 脾細胞培養分別于感染后第0、3、5、8、10、12、15天，常規無菌取出小鼠脾臟，用RPMI 1640培養液制備濃度為1×107個/mL脾細胞懸液，于24孔培養板中培養48 h后，收集培養上清，－80℃保存，待IFN-γ和IL-4檢測。

1.2.3 細胞因子檢測用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測IFN-γ和IL-4產生水平。酶標儀測定450 nm處OD值。結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應用SoftMax Pro 4.3.1LS軟件分析，計算細胞因子含量(pg/mL)。

1.2.4 流式細胞術檢測脾細胞中CD4+T細胞的凋亡數量取binding buffer制備的1×106個/mL脾細胞懸液0.1 mL，加入流式細胞儀專用染色管中，每份樣品設陰性對照管、CD4-FITC單標及其Annexin V-PE單標管，另一管加入抗CD4-FITC和AnnexinV-PE各5 μL。25℃避光孵育15 min，每管加binding buffer 400 μL，1 h內上機。利用流式細胞儀(FACSCalibur，美國B＆D公司)，激發波長為488 nm，利用FACS CELLQUEST軟件獲取細胞，每個樣品分析10000個細胞，使用前向散射角(FSC)及側向散射角(SSC)確定淋巴細胞群，以陰性對照為參考，將對照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點陣圖顯示，記錄CD4+T細胞凋亡的百分率。

1.2.5 統計學處理應用SPSS 11.5統計學分析軟件，各組之間指標的差異性檢驗選用配對t檢驗分析，P＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種瘧原蟲感染小鼠的原蟲血癥水平及生存率

P.y17XL和P.c AS感染小鼠分別于感染后第2天和第4天，外周血中出現瘧原蟲感染的紅細胞。隨后，P.y17XL感染小鼠原蟲血癥水平迅速持續升高，感染后第5天達峰值約60%，小鼠于感染后第5天及次日全部死亡;相比，P.c AS感染小鼠原蟲血癥水平上升緩慢，感染后第8天達到峰值僅為41%左右，隨后迅速下降，于感染后第14～16天自愈，小鼠生存率為100%(見圖1)。

2.2 兩種瘧原蟲感染小鼠脾細胞上清中IFN-γ和IL-4水平檢測

P.y17XL感染小鼠脾細胞上清中IFN-γ水平僅在感染后第3天出現一過性有意義的升高(P＜0.01)，隨后迅速下降;P.c AS感染小鼠脾細胞上清中IFN-γ水平在感染后第3天出現有意義升高，第5天達峰值(P＜0.01)，隨后下降至正常水平(見圖2)。P.y17XL感染小鼠脾細胞上清中IL-4水平僅在感染后第3天出現有意義升高(P＜0.05)，而P.c AS感染小鼠脾細胞上清中IL-4水平在感染后第8天出現有意義的升高，第10天達峰值(P＜0.01)，此后雖有回落但仍維持較高水平(見圖3)。

圖2 不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠后脾細胞培養上清中IFN-γ水平Fig.2The level of IFN-γ from splenocytes supernatant of BALB/c mice infected with P.y17XL or P.c AS on different time points＊＊P＜0.01 indicate the significant difference compared with control mice(non-infected mice，0d)＊＊P＜0.01表示與正常對照組相比差異顯著

圖3 不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠后脾細胞培養上清中IL-4水平Fig.3The level of IL-4 from splenocytes supernatant of BALB/c mice infected with P.y17XL or P.c AS on different time points *P＜0.05 and＊＊P＜0.01 indicate the significant difference compared with control mice(non-infected mice，0d) *P＜0.05和＊＊P＜0.01表示與正常對照組相比差異顯著

2.3 兩種瘧原蟲感染小鼠脾細胞中CD4+T細胞凋亡數量的檢測

P.y17XL感染小鼠脾細胞中CD4+T細胞凋亡數量于感染后第3天出現有意義升高(P＜0.01)，于感染后5 d達到峰值(P＜0.01)。相比，P.c AS感染的小鼠脾細胞中CD4+T細胞凋亡數量于感染后變化不明顯，僅于感染后第8天其數量和正常組小鼠相比具有統計學意義(P＜0.01) (圖4)。

圖4 不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠后不同時間脾細胞中CD4+T細胞凋亡數量變化Fig.4CD4+T cell apoptosis in P.y17XL or P.c AS-infected BALB/c mice

3 討論

關于紅內期瘧原蟲感染的免疫機制，無論鼠瘧模型和人體試驗研究結果均已證實:CD4+T細胞在抵抗紅內期瘧原蟲感染過程中發揮至關重要的作用，Thl-Th2連續活化是確保保護性免疫效應發揮的關鍵［7-8］。Thl/Th2之間的平衡及協調不但能夠控制急性期的危象，而且最終能夠清除瘧原蟲。

本研究顯示在P.y17XL感染3 d后，BALB/c小鼠的原蟲血癥水平迅速持續上升，至感染后第5天高達60%，小鼠全部死亡，同時IFN-γ和IL-4分泌水平僅在感染后第3天出現一過性有意義的升高，而且峰值較低，這一結果提示BALB/c小鼠在瘧原蟲感染早期未能建立有效的Thl應答控制紅內期瘧原蟲的爆發性增殖，導致最終死亡的感染結局。與P.y17XL相比，P.c AS生長相對緩慢，所以宿主的免疫系統對生長快慢不同的瘧原蟲反應就具有差異性［9］。BALB/c小鼠感染P.c AS，瘧原血癥于感染后第8天達到峰值僅為41%;IFN-γ分泌水平在感染后第5天達峰值，IL-4分泌水平在感染后第10天達峰值，且峰值較高維持時間較長，小鼠全部存活，這一結果提示BALB/c能夠對P.c AS建立有效地Th1型免疫應答，并且成功地從Th1向Th2型應答過渡。

外來抗原刺激CD4+T細胞活化、克隆增殖后，活化的T細胞通過活化誘導性細胞死亡(AICD)方式及一種凋亡的形式完成免疫應答中的使命。細胞活化后死亡是機體維持免疫穩態的必要條件。然而細胞凋亡的數量或時相往往影響有效免疫應答的建立或免疫記憶的維持［10-11］。本研究發現，P.y17XL感染早期BLAB/c未建立有效的Th1應答，同時伴隨CD4+T細胞大量凋亡，直至小鼠死亡;而P.c AS感染小鼠能夠建立有效地Th1型免疫應答，并且Th1向Th2型應答有序過渡，而凋亡細胞數量于感染后8 d出現有意義升高，小鼠全部存活。這一結果提示，P.y17XL感染的BALB/c小鼠未能建立有效的抗瘧應答可能與CD4+T細胞凋亡過早或過度發生有關，而P.c AS感染的BALB/c小鼠正是由于CD4+T細胞的適宜凋亡而能建立有效的Th1免疫應答，同時又有序過渡到Th2免疫應答。

綜上所述，本實驗對BALB/c小鼠感染不同瘧原蟲的免疫應答模式和應答效應進行了初步探討，再次證實Thl和Th2型免疫應答的有效建立和協調過渡對抵抗瘧疾感染至關重要，同時提示感染早期出現的大量細胞凋亡很可能使小鼠處于免疫抑制狀態而不能建立有效的Th1應答和Th1與Th2應答的有序過渡，其相關的調節機制尚有待進一步闡明。

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Characteristic Comparison of CD4+Th Immune Responses and Apoptosis in BALB/c Mice Infected with Different Plasmodia

ZHENG Li1，SUN Xiao-dan2，PAN Yan-yan1，FENG Hui1，CHEN Guang3，ZHOU Hong-xu1，CAO Ya-ming1
(1.Teach.＆Res.Div.of Immunol.，Coll.of Basic Med.，2.Basic Teach.Ctr.，Coll.of Clin.Med.，China Med.Uni.，Shenyang 110001; 3.Teach.＆Res.Div.of Parasotol.，Coll.of Basic Med.Jiamusi Uni.Jiamusi 154000)

Immune response characteristics in BALB/c mice infected with different plasmodia were investigated.BALB/c mice were infected by intraperitoneal injection with 1×106virulent P.yoelii 17XL or P.chabaudi AS parasitized erythrocytes，Splenocyte IFN-γ and IL-4 producing levels were measured by dynamic ELISA.The apoptosis of CD4+T cell was detected by flow cytometry.The results showed that during early stage of P.y 17XL infection，the parasitaemia of mice continuously increased and the secretion levels of IFN-γ and IL-4 appeared a transient significant increment only on d3 post-infection，though with low peak value;and a large number of CD4+T cells of spleen went apoptosis，and all mice died.However，the increment of parasitemia of mice infected with P.c AS was slow and the levels of IFN-γ reached to peak value on d5 post-infection，and IL-4 on d10 post-infection;And the time of peak value was maintained fairly long;a significant increment of the CD4+T cells of spleen apoptosis appeared d8 post-infection，and all mice survived.Therefore，protective immunity against malaria infection depended on the establishment of effective Th1 and Th2 responses and coordinative transition.The time phase and quantity of CD4+T apoptosis duringthe early infection might be a reason that affected the immune response strength and/or caused the immune of the host to inhibit，thereby affected the outcome of the host to infect the plasmodia.

BALB/c mice;Plasmodium yoelii;Plasmodium chabaudi;Th immune response，apoptosis

R392

A

1005－7021(2011)01－0019－05

國家自然科學基金(30800961)

鄭麗女，講師，博士研究生。現從事抗感染免疫工作。E-mail:zli77@yahoo.com.cn

*通訊作者。Tel:024-23256666-5346，E-mail:yamingcao@yahoo.com.cn

2011-01-16;

2011-01-20