1株甲基桿菌Methylobacterium sp.WGM16的鑒定及降解甲醇的最佳培養條件

田丹丹，宋修鵬，蔣承健，古恒森，李俊芳，武波

( 1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005 ; 2.微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室，廣西南寧530005 ; 3.廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西南寧530005 ; 4.廣西民族大學化學與生態工程學院，廣西南寧530007 )

1株甲基桿菌Methylobacterium sp.WGM16的鑒定及降解甲醇的最佳培養條件

田丹丹1，2，3，宋修鵬1，2，3，蔣承健1，2，3，古恒森1，2，3，李俊芳1，2，3，武波2，3，4*

( 1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005 ; 2.微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室，廣西南寧530005 ; 3.廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西南寧530005 ; 4.廣西民族大學化學與生態工程學院，廣西南寧530007 )

從水稻根部土壤中篩選到1株粉紅色、需氧的兼性甲基營養型菌株WGM16，該菌為革蘭陰性桿菌。根據菌株16S rRNA基因序列比對分析及結合菌株常規形態特征、生理生化性狀的鑒定，將該菌初步鑒定為Methylobacterium sp.PCR擴增到菌株WGM16編碼甲醇脫氫酶α-亞基的mxaF基因，表明菌株WGM16中存在甲基營養代謝途徑。在培養溫度為32℃、以1%的甲醇作為碳源、pH值為8.0的培養條件下，其甲醇降解率可達75%。

甲基桿菌;WGM16;鑒定;甲醇降解率

甲基營養菌是一類能夠利用包含一個碳原子，或包含多個碳原子但碳原子之間卻沒有碳碳鍵的化合物作為唯一碳源和能源生長的微生物［1］。它們能夠利用大多數生物不能夠利用的一類物質，如甲醇、甲醛、甲胺、甲酸。甲基桿菌屬是粉紅色的、需氧的、革蘭陰性桿狀的兼性甲基營養菌［2］。甲基桿菌屬除了能利用上述單碳化合物作為唯一碳源和能源進行生長外，也能夠利用一系列廣泛的多碳化合物作為底物生長。甲基桿菌在自然界中普遍存在，在各種環境中(如土壤、灰塵、淡水、湖泥、葉表、根瘤、稻谷、醫院環境)都有存在［3］。它們能夠代謝存在于植物碎屑中的微細產物。因此，甲基桿菌在自然界碳循環中起到重要的作用。甲醇、甲醛對人體和各種微生物都有毒性。甲基桿菌可通過其一碳代謝途徑將甲醇、甲醛等進行代謝轉化，因此可以利用其進行甲醇廢水的處理。在利用單碳化合物作為碳源和能源生長的同時，其會代謝產生多種有益的副產物，如甲醇蛋白、多種輔酶、維生素B12、聚β羥基丁酸鹽、各種氨基酸(L-絲氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸)等［4］。本研究從水稻根部通過富集培養分離到了1株甲基桿菌WGM16，豐富了甲基營養菌的物種資源，可為研究甲基桿菌的一碳代謝途徑提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

培養基①完全培養基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，葡萄糖4 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0;②基本培養基:(NH4)2HPO43 g/L，K2HPO42 g/L，NaCl 1 g/L，煙酸20 μg/L，VB110 μg/L，VB220 μg/L，泛酸鈣20 μg/L，吡哆醇20 μg/L，生物素10 μg/L，對氨基苯甲酸10 μg/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·4～6H2O 5 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離及純化取水稻根部附近1 g土樣，用100 mL無菌水進行稀釋，取1 mL稀釋液加入到100 mL含1%無水甲醇的完全培養基中30℃富集3～4 d，然后涂布到以1%的無水甲醇為唯一碳源和能源的基本培養基的平板上，放入30℃恒溫箱中培養3～4 d，挑選長勢較好的菌株反復劃線純化。

1.2.2 菌株的鑒定①菌株形態特征及生理生化特征測定:見參考文獻［5］;②16S rRNA基因序列、mxaF基因序列及系統發育分析:用購自BioFlux的基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的基因組DNA作為模板，用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')擴增該菌株的16S rRNA。用mxaF-f(5'-GCGGCACCAACTGGGGCTGGT-3')和mxaF-r(5'-GGGCAGCATGAAGGGCTCCC-3')擴增該菌株的mxaF基因。PCR產物電泳后用BioFlux公司的凝膠回收試劑盒純化后送上海生工進行測序。測序結果在NCBI數據庫中用BLAST進行比對，并用MEGA 4.0版本進行系統進化樹分析。

1.2.3 菌株生長條件的優化以空白培養基為對照，將對數期生長的菌液(OD600=0.8)按1%的接種量接入到100 mL的三角瓶中，檢測菌株在不同甲醇濃度、溫度、pH下OD600的吸收值。

1.2.4 甲醇殘余量檢測用氣相色譜法檢測菌株對甲醇的利用情況。島津GC-14C型氣相色譜，FID檢測器，高純氮氣為載氣，固定液:OV-1701，擔體:Chromosorb WAW DMCS。柱溫:60℃，進樣器:180℃，檢測器:210℃。

2 結果與分析

2.1 WGM16的形態及生理特征鑒定

WGM16在固體基本培養基中，菌落圓形，不透明，粉紅色，表面光滑，邊緣整齊。光學顯微鏡下觀察，細胞桿狀。革蘭陰性，有類脂粒(聚-β-羥基丁酸鹽顆粒)。電鏡下觀察WGM16具有鞭毛(見圖1)。WGM16具有Nm、Amp、Cb抗性。

圖1 菌株WGM16在透射電鏡下的照片Fig.1Transmission electron microscopy micrograph of strain WGM16

2.2 WGM16的分子生物學分析鑒定

2.2.1 16S rRNAPCR擴增WGM16的16S rRNA，連載體后送生工測序，得到1446 bp的片段。在NCBI中進行Blast比對發現與M.lusitanum MP2的16S rRNA有99%的序列相似性。

2.2.2 mxaF基因PCR擴增WGM16的mxaF基因連載體后測序得到530 bp的片段。在NCBI中進行Blast比對與Methylobacterium lusitanum strain MP2 methanol dehydrogenase有98%的序列相似性。

圖2 根據16S rRNA序列構建的WGM16和甲基桿菌屬其他相關菌株的進化樹Fig.2Phylogenetic dendrogram obtained by 16S rRNA gene sequences，showing the position of strain WGM16 among its phylogenetic neighbours

圖3 根據mxaF基因序列構建的WGM16和其他相關菌株的系統發育樹Fig.3Phylogenetic dendrogram obtained by distance-matrix analysis of mxaF gene sequences，showing the position of strain WGM16 among its phylogenetic neighbours

2.3 生理生化鑒定

根據細菌鑒定手冊中鑒定甲基桿菌屬的主要生理生化指標進行鑒定，如表1。結果發現菌株WGM16與甲基桿菌屬主要指標都相符。表明WGM16為甲基桿菌屬。

2.4 WGM16對碳源的利用情況

用Biolog公司的細菌鑒定儀對菌株WGM16做碳源情況分析，發現WGM16能利用D-麥芽糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二糖、棉子糖、N-乙酰-D-葡糖胺、α-D-葡萄糖、D-果糖、1%乳酸鈉、D-絲氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、鹽酸胍、L-乳酸、檸檬酸、D-蘋果酸、溴-丁二酸、氯化鋰、萘啶酮酸、亞碲酸鉀、β-羥基-L-丁酸、丙酸、乙酸、氨曲南、丁酸鈉。根據WGM16在進化樹分支中的位置，比較WGM16與Methylobacterium lusitanum［6］、Methylobacterium thiocyanatum［7］、Methylobacterium rhodesianum［8］、Methylobacterium populi［9］對不同碳源的利用情況，如表2所示。

表1 WGM16和甲基桿菌屬生理生化性質的比較Table 1Comparation of the physiological and biochemical of WGM16 with related Methylobacterium sp.members

表2 甲基桿菌屬對不同碳源底物的利用情況Table 2Differential carbon-substrate utilization among Methylobacterium species

2.5 甲醇降解的最佳培養條件

2.5.1 不同甲醇濃度對WGM16生長的影響

將WGM16接種于甲醇含量為1%、2%、3%為唯一碳源和能源的基本培養基上，pH 7.0，32℃搖床培養，每隔6 h測定菌株OD600。由圖4可知，菌株WGM16在甲醇濃度為1%時長勢較好。

圖4 WGM16在不同甲醇濃度下的生長曲線Fig.4The growth curve of WGM16 on different content of methanol

2.5.2 不同pH對WGM16生長的影響將WGM16接種于1%的甲醇為唯一碳源和能源、pH分別為5、6、7、8、9的基本培養基中，32℃搖床培養，每隔6 h測定菌株OD600。菌株WGM16在pH 8.0時明顯比其他pH時長勢好，在pH 5.0及pH 6.0時基本不長，見圖5。

圖5 WGM16在不同pH下的生長曲線Fig.5The growth curve of WGM16 on different pH

2.5.3 不同溫度對WGM16生長的影響將WGM16接種于1%的甲醇為唯一碳源和能源，pH 8.0的基本培養基上，分別放入28、30、32、37℃搖床中，每隔6 h測定菌株OD600。由圖6可知，菌株WGM16在溫度為32℃時長勢明顯比其他溫度要好。

圖6 WGM16在不同溫度下的生長曲線Fig.6The growth curve of WGM16 on different temperature

2.6 WGM16的耐鹽性分析

將WGM16接種于1%的甲醇為唯一碳源和能源，pH 8.0，NaCl濃度分別為1%、2%、5%、7%、10%的基本培養基中，32℃搖床培養，每隔6 h測定菌株OD600。由圖7可知，菌株WGM16具有較高的耐鹽性。

圖7 WGM16在不同NaCl濃度的生長曲線Fig.7The growth curve of WGM16 on different content of NaCl

2.7 WGM16在不同時間對甲醇的降解情況

將WGM16按1%的接種量接種到1%的甲醇為唯一碳源和能源，pH 8.0的基本培養基中，32℃搖床培養，以空白培養基為對照，檢測菌株WGM16在生長過程中甲醇的降解情況，發現最終可降解75%的甲醇，見圖8。

圖8 WGM16在不同時間內的甲醇降解率Fig.8The degradation curve of methanol during the growth of WGM16

3 討論

本研究從水稻根部土壤中篩選到1株產粉紅色色素的兼性甲基營養菌。分析菌株16S rRNA序列和其在進化樹中的位置以及與甲基桿菌屬各項生理生化特征的比較，表明菌株WGM16屬于甲基桿菌屬。菌株WGM16在進化樹中的位置與M.lusitanum最近，但是與M.lusitanum不同的是WGM16能夠利用葡萄糖和二甲胺，而M.lusitanum卻不能利用，WGM6不能夠利用甲酸，M.lusitanum卻能夠利用。表明菌株WGM16可能是甲基桿菌屬中的一個新種。PCR擴增到菌株WGM16編碼甲醇脫氫酶α-亞基的mxaF基因，表明菌株WGM16中存在甲基營養代謝途徑。菌株WGM16為微嗜堿性菌株，在pH為5.0和6.0時基本不長。在4℃和37℃時都不能生長。菌株WGM16有很高的耐鹽性，1%≤NaCl濃度≤10%時都能生長。在1%的甲醇為碳源、pH 8.0、32℃時菌株WGM16長勢最好。在此條件下對甲醇的降解率可達到75%。菌株WGM16能產生β-羥基丁酸鹽顆粒，可為研究一碳代謝途徑中PHB的循環奠定基礎。同時該菌能夠生產L-絲氨酸，但也能夠利用L-絲氨酸作為氮源生長，對研究微生物發酵生產L-絲氨酸具有應用價值。

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［3］Corpe，W.A.＆Rheem，S.Ecology of the methylotrophic bacteria on living leaf surfaces［J］.FEMS Microbiol Ecol，1989，(62):243-250.

［4］Green，P.N.Methylobacterium［J］.Prokaryotes，2006，(5): 257-265.

［5］東秀珠，蔡妙英，等.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，2001:353-398.

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［7］Ann P W，Donovan P K，Ian P M，et al.A novel pink-pigmented facultative methylotroph，Methylobacterium thiocyanatum sp.nov.，capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen sources［J］.Arch Microbiol，1998，(169):148-158.

［8］Rock，J S.Goldberg，I.Ben-Bassat，A.et al.Isolation and characterization of two methanol-utilizing bacteria［J］.Agric Biol Chem，1976，(40):2129-2135.

［9］Van Aken，B.Peres，C M.Lafferty Doty，S.et al.Methylobacterium populi sp.nov.a novel aerobic，pink-pigmented，facultatively methylotrophic，methane-utilizing bacterium isolated from poplar trees［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2004，(54):1191-1196.

Identification of a Methylobacterium sp.Strain WGM16 and Its Optimal Culture Conditions to Degrade Methanol

TIAN Dan-dan1，2，3，SONG Xiu-peng1，2，3，JIANG Cheng-jian1，2，3，GU Heng-sen1，2，3，LI Jun-fang1，2，3，WU Bo2，3，4
(1.Coll.of Life Sci.＆Technol.，Guangxi Uni.，Nanning 530005; 2.Key Lab.of Microbial＆Plant Gen.Engin.of Min.of Educ.，Nanning 530005; 3.Key Lab.of Subtrop.Bio-Res.Conserv.＆Util.of Guangxi，Nanning 530005; 4.Coll.of Chem.and Ecol.Engin.，Guangxi Uni.for Nationalities，Nanning 530007)

A pink，aerobic，and facultative methylotrophic bacterium strain WGM16，was isolated and screened from rice’s root soil.It was Gram-negative rod.Comparison analysis of 16S rRNA gene sequence and physiological and biochemical characteristics combined with routine morphological，physiological and biochemical characteristics identification，the strain WGM16 was identified as a member of the genus Methylobacterium sp.PCR amplification showed the gene coding for the α-sub-radical of methanol dehydrogenase(mxaF)present in the strain WGM16，indicating there existed a methylotrophic metabolism.Under the conditions of temperature at 32℃，with 1%of methanol as carbon source，pH 8.0，the methanol degradation rate was as high as 75%.

Methylobacterium;WGM16;identification;methanol degradation rate

S154.3

A

1005－7021(2011)01－0028－06

廣西青年科學基金資助項目(桂科青0832011);廣西大學科研基金(X081074)

田丹丹女，碩士研究生。研究方向為分子生物學。

*通訊作者。Tel:0771-3239283，E-mail:wubogxu@yahoo.com.cn

2010-11-22;

2010-01-14