大鼠腦彌漫性軸索損傷后早期病理學的研究

陳仁輝

(福建警察學院刑事科學技術系,福建福州 350007)

大鼠腦彌漫性軸索損傷后早期病理學的研究

陳仁輝

(福建警察學院刑事科學技術系,福建福州 350007)

目的:探討大鼠腦彌漫性軸索損傷(DAI)后早期軸索病理學改變及c-Fos蛋白的變化,為DAI的早期法醫病理學鑒定尋找新的依據1方法:參照Marmarou的打擊負荷傷模型,建立大鼠DAI動物模型1運用神經纖維特殊染色法觀察軸索的病理學改變,并運用免疫組化SABC法觀察c-Fos的變化1結果:嗜銀染色于打擊后1 h即可觀察到部分神經纖維不規則增粗、腫脹、少數斷裂,6 h觀察到軸突斷端球形改變,24 h可見典型軸索收縮球1打擊后15 min時,即可觀察到c-Fos的表達,3 h達到高峰,24 h后仍可見一定量表達,表達呈彌漫性,以胼胝體、腦干最為明顯1對照組未見陽性反應1結論:嗜銀染色可以很好的觀察DAI后軸索的病理學改變1c-Fos是腦彌漫性軸索損傷的靈敏指標,對于早期DAI的診斷具有一定的應用價值.

彌漫性軸索損傷; 嗜銀染色; c-Fos; 免疫組織化學

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury1DAI)是顱腦損傷的一種重要形式,它在重型閉合性顱腦損傷中占20%1DAI可以導致顱腦損傷患者死亡(死亡率高達42%～62%[1])、植物生存或嚴重的神經功能障礙,是外傷性腦損傷中最嚴重的損傷之一1DAI由于缺乏特異性的神經定位體征以及影象學改變,其最終診斷需要通過組織病理學,但是早期的DAI往往沒有典型的病理學改變,所以如何鑒定早期的DAI是法醫病理學工作者面臨的一大難題.

本研究擬通過建立大鼠DAI動物模型,運用神經纖維特殊染色法觀察不同時間、不同部位軸突的病理學改變1并對其不同時間、不同部位腦損傷后c-Fos表達的變化進行觀察,期望能為DAI早期法醫學鑒定提供客觀的病理形態學依據.

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性SD大鼠48只(南京青龍山實驗動物中心提供),體重300～350 g,隨機分成DAI 15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h組及對照組,共8組1每組6只大鼠.

1.2 DAI動物模型制作 采用Marmarou腦損傷模型[2],用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg),麻醉成功后,大鼠頭部做中線切口,暴露顱骨,將直徑10 mm、厚3 mm的打擊墊片用高分子聚脂固定于顱頂的冠狀縫與人字縫之間的中央部,然后將大鼠俯臥固定

已知厚度及彈性系數的海綿床上,待動物開始蘇醒,有肢體活動時,移至有機塑料管下端,墊片正對管中央1450 g鐵棒從2 m高度自管內自由墜落至打擊墊片上,立即移開海綿床以免二次損傷1在設定的時間內將動物過量麻醉后,斷頭取腦.

1.3 組織及切片處理 打開顱骨后迅速用4%多聚甲醛液預固定,取出大鼠全腦于4%多聚甲醛液后固定12 h,沿大腦正中裂矢狀切開大腦、小腦、腦干,于正中切面左右外側3 mm處切取左右大腦皮質、胼胝體、丘腦以及腦干組織各一塊,分別做常規石蠟包埋1切片厚5 um,分別作HE染色、嗜銀染色及c-Fos免疫組織化學染色.

1.4 試劑及方法 硝酸銀、氯化金、硫代硫酸鈉、飽和氨水,按G lees-Marslands染色法[3]進行1Rabbit Anti -C-FOS(北京金山公司);DAB顯色試劑盒及SABC試劑盒(武漢博士德公司),按說明書進行操作1用PBS取代一抗、二抗作陰性對照,以細胞核/漿出現黃色產物為陽性結果.

2 結果

2.1 動物觀察

動物受到打擊后,出現即刻的呼吸暫停數秒,隨即進入持續昏迷狀態,有的動物在昏迷期間偶伴抽搐1所有的動物表現為豎毛,少數動物出現尿失禁、全身痙攣、四肢強直15只動物(約10%)于打擊后數分鐘

呼吸停止,死亡1動物清醒后表現為活動減少,部分出現肢體活動受限1對照組動物無明顯變化.

2.2 HE染色

實驗組可見蛛網膜下腔出血,少數動物可見腦干有淤斑性出血、側腦室出血1未見腦組織局灶性病灶1神經元胞體明顯腫脹,結構不清,核固縮,胞漿紅染加深,神經元損害主要分布于兩側大腦皮質1膠質細胞腫脹明顯1細胞周圍間質水腫.

2.3 嗜銀染色

打擊后1 h即可觀察到部分神經纖維不規則增粗、腫脹、少數斷裂(圖1),6 h神經纖維明顯增粗、腫脹并呈串珠狀、波浪狀或螺旋狀改變,斷端膨大呈球形(圖2),12 h收縮球較為明顯,24 h可見典型軸索收縮球,且數量增多(圖3).

圖1 腦損傷后1 h,少數神經纖維不規則增粗 嗜銀染色×400

圖2 腦損傷后6 h,神經纖維明顯增粗,呈波浪狀改變 嗜銀染色×400

圖3 腦損傷后24 h,神經纖維斷端球形改變 嗜銀染色×400

圖4 腦損傷后15 min,c-Fos陽性反應細胞,散在少量分布 SABC×200

2.4 c-Fos免疫組織化學染色

打擊后15 min,即可觀察到c-Fos陽性反應細胞,呈散在少量分布(圖4).陽性產物呈棕黃色,主要位于胞核內,胞漿內以及大的突起根部也有表達(圖5). 1 h后表達明顯增加,并于3 h達到高峰(圖6).隨著時間延長,c-Fos陽性反應細胞逐漸減少,24 h可見少量表達.表達以皮層、腦干最為明顯,陽性反應細胞包括神經元及各類膠質細胞.正常對照組未見c-Fos陽性反應細胞.

圖5 腦損傷后,c-Fos陽性反應產物在胞核、胞漿以及大的突起根部表達 SABC×200

圖6 腦損傷后3 h,c-Fos陽性反應細胞明顯增加 SABC×200

3 討論

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury1DAI)是一種特殊類型的腦損傷,它是從病理學角度提出的概念,其發現至今已有數十年的時間.嗜銀染色是顯示神經軸突的傳統方法,可用于觀察軸突在損傷后的病理改變,如彎曲、腫脹、斷裂及回縮球形成等.有研究發現[4],神經軸突在傷后1～2 h,軸索變粗,進而腫脹呈串珠狀、波浪狀或螺旋狀改變,傷后12 h以上,出現典型軸索收縮球.本研究發現DAI后1 h即可觀察到部分神經纖維不規則增粗、腫脹、少數斷裂,6 h斷端膨大呈球形,12 h收縮球較為明顯,24 h可見典型軸索收縮球1這與文獻報道基本一致.嗜銀染色可以較早、較好的觀察軸索的病理學改變.

近年來,隨著對DAI研究的不斷深入,發現外力除引起原發性軸索損傷(primary axonal injury)外,更多的是導致非中斷性軸索損傷(nondisruptive axonal injury)[5],即軸索在受傷當時并不出現斷裂,而是隨病程發展,軸索逐漸出現繼發性病理改變,最終于傷后數小時才發生軸索中斷,即繼發性軸索斷裂(secondary axonal injury)1非中斷性軸索損傷后至延遲性軸索斷裂及軸縮球的形成,這期間是一個復雜的病理生理學過程1c-Fos是c-fos基因激活后轉錄生成的mRNA編碼的核蛋白1當神經組織受到病理性刺激如腦缺血、癲癇和外傷等作用時,c-fos基因快速表達[6,7],因此被稱為快速反應原癌基因(pro-oncogene),屬于即早基因家族(immediate early gene,IEGS).c-fos基因被激活后通過fos/jun二聚體,構成活化蛋白-1(AP-1)轉錄因子調控下游基因的表達[8],所以在中樞神經系統對創傷的初始應答與繼發性病理生理改變之間c-fos基因的激活可能成為重要的中介.本研究發現打擊后15 min,即可觀察到c-Fos陽性反應細胞,1 h后表達明顯增加,并于3 h達到高峰,24 h后可見少量表達.c -fos基因的早期表達是對外界損傷性刺激直接而快速的反應,它的中介作用可能啟動了繼發性軸索斷裂.

Smeyne等[9]學者認為c-fos過度表達似乎是細胞終末分化的標志及死亡先兆,且先于細胞出現生化和死亡形態學改變數小時至數天.c-fos基因表達是神經組織受傷害的早期指標.本研究發現在嗜銀染色尚未檢見DAI病理改變時,c-Fos就有表達,c-Fos是DAI的靈敏指標,當然由于神經組織受到其他病理性刺激如腦缺血、癲癇等作用時也有表達,所以c-Fos用于DAI的早期診斷時需要結合大體及病史1我們認為c-Fos對于早期DAI的診斷具有一定的應用價值1參考文獻:

[1]Bennett MO,Brien DP,Philips JP,et al.Clinicopathologic observation in 100 consecutive patients with fatal head injury admitted to a neurosurgical unit[J].Ir Med J,1995,88: 60-69.

[2]Foda MA,Marmarou A.A new model of diffuse brain injury in rats.Part II:Morphological characterization[J].Neurosurg, 1994 Feb;80(2):301-313.

[3]孔慶雷譯.組織病理學與組織化學技術手冊(第1版) [M].北京:科學出版社,1982,445-446.

[4]AdamsJ N,Poveishocks.Diffuse axonal injury in head injury, definition,diagnosis and grading[J].Histopathol,1989, 15:49-54.

[5]PovlishockJT,ChristmanCW.Thepathobiologyof traumatically induced axonal injury in animals and humans:a review of current thoughts[J].Neurotrauma,1995,12 (3):555-564.

[6]G iza CC,Prins ML,Hovda DA,et al.Genes prefereutially induced by depolarization after concussive brain injury:effects of age and injury severity[J].Neurotrauma,2002,19(4): 387-395.

[7]Morgan S,Greenberg ME.The regulation andfuction of c-fos and other IEGS in the neurous system[J].Neuron,1990,4 (2):477-487.

[8]Kaminska B,Kaczmarek L.Robust induction of AP-1 transcription factor DNA binding activity in the hippocampus of aged rats[J].Neurosci Lett,1993,153:189-191.

[9]Smeyne RJ,Vendrell M,Hayward M et al.Continous c-fos expression precedes programmed celldeath in vivo[J]. Nature,1993,363(1):166-174.

Abstract:Objective:T o explore the changes of c-Fos in early stage of diffuse axonal injury(DAI)in rats so as to find a new evidence for early forensic pathologic diagnosis of DAI.Methods:Based on Marmarou's impact/compression trauma model, the rat model of DAIwas established.ImmunohistochemicalSABC method was used to observe the expressionof c-Fos,combining special stainingof neurol fibers to observe the changesof axons.Results:It wasfound that swollen and ruptured axon in brain stem at 1h,marked swelling of the axonal severe end at 6 h,axonal retraction ball at 24 h by silver staining after DAI.The expression of c-Fos could be detected at 15 min after injury,peaked at 3 h.The expression of c-Fos was found in wide range but significant in callus and brain stem.The control group showed negative staining.Conclusion:Silver staining is a good way to observe the changes of axons.c-Fos is a sensitive index to DAI and is helpful to diagnose early DAI.

Key words:diffuse axonal injury; silver staining; c-Fos; immunohistochemistry

A Study on Pathologic Changes in Early Stage of Diffuse Axonal Injury in Rats

CHEN Ren-hui
(Department of Criminal Sciences and Technology,Fujian Police Institute,Fuzhou,Fujian 350007)

Q956

A

1671-9743(2011)02-0048-05

2010-12-01

福建省教育廳資助,課題編號:JA071901

陳仁輝(1979-),男,安徽寧國人,福建警察學院講師,碩士,主要從事閉合性顱腦損傷的分子病理學研究.