毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析

蘇 波

(長沙外國語學校,湖南長沙 410001)

毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析

蘇 波

(長沙外國語學校,湖南長沙 410001)

采用D-101大孔樹脂吸附和正丁醇萃取兩種不同的方法對毛茛皂苷進行提取分離,對分離純化后的樣品采用紫外可見光全波長掃描分析和高效液相色譜純度和含量鑒定1結果表明分離純化后的毛茛皂苷在209 nm處有最大吸收峰,正丁醇萃取的毛莨皂苷含量比大孔樹脂吸附分離的較高.以毛茛皂苷對9種不同細菌進行抑菌實驗,顯示毛茛皂苷對綠膿桿菌、糞腸球菌、產氣腸球菌、金黃色葡萄球菌均具有較明顯的抑菌作用.

毛茛皂苷; 大孔樹脂吸附; 正丁醇萃取; 抑菌作用

毛茛(Ranunculus japonicusThunb)是毛茛科(Ranunculaceae)毛茛屬(Ranunculus)植物,以帶根全草入藥,又名老虎腳跡、五虎草等.生于田溝旁和林緣路邊的濕草地上,除西藏外,在我國各省區廣布1味辛,性溫,有毒.具有利濕、消腫、止痛、退豁、截瘧、殺蟲之功效,中醫臨床用于主治瘧疾、黃疽、偏頭痛、胃痛、風濕關節痛、鶴膝風、癰腫、惡瘡、疥癬、牙痛、火眼等疾病.毛茛始載于《本草拾遺》,在《本草綱目》中也有記載,應用歷史悠久[2]1

毛茛種類多,在我國分布廣,其藥用價值逐漸得到重視,迄今為止,國已內相繼從毛茛中分離得到了20個化合物.近年來對毛茛的研究表明其具有抗菌殺菌、抗組胺、抗腫瘤、松弛血管或子宮平滑肌以及在農業方面具有殺滅病蟲害等作用[1]1皂苷廣泛分布于自然界,包括三萜皂苷和甾體皂苷,因水溶液振搖后可生成膠體溶液,并有持久性似肥皂溶液的泡沫而得名[2].藥理研究證明,皂苷具有抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗病毒、降低膽固醇、降血糖和免疫調節等多方面的生物活性和藥理作用[3].由于毛茛皂苷提取物往往被認為有效成分含量低、雜質多、質量不穩定,用藥多建立在經驗的基礎上,難以與現代醫學接軌1為解決這個問題,研究并優化毛茛皂苷的提取與純化工藝十分必要.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料采集與處理

本研究所用材料于2009年7-9月份采自當地田野、道旁,經專家鑒定為毛茛(Ranunculus japonicus Thunb)1毛茛采回后用自來水洗凈,去根,置于陰涼通風處自然干燥,然后用DS—1組織粉碎機粉碎,40目篩子過篩并保藏待用1

1.1.2 供試菌種及試劑

供試大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、產氣腸桿菌、副甲硫桿菌、雞沙門氏菌9菌種均來自于湖南師范大學;實驗藥品均為國產試劑1

1.2 實驗方法

1.2.1 毛茛粗提物制備

精密稱取50 g毛茛粉末兩份(分別用于正丁醇萃取和樹脂吸附制備皂苷),分別加500 ml 70%乙醇浸泡24小時后超聲波輔助提取(超聲波條件t=45 min,T =30℃,W=750 w,超聲間隙2 s),然后用四層紗布過慮.將濾渣再加500 ml 70%乙醇重復此操作,合并提取液1將提取液抽濾后,旋轉蒸發(130 pa,60℃)濃縮,得到毛茛粗提液.將粗提液先用等體積的石油醚萃取1-2次,再用等體積的乙酸乙酯萃取4-5次,直至上層(乙酸乙酯)為淺綠色,留下層液待用(待用液).

1.2.2 毛茛皂苷的制備

[2]中皂苷的提取,將以上待用液用等體積的正丁醇萃取2-3次,合并萃取液后低溫旋轉蒸發得到浸膏,加20 ml蒸餾水溶解得到棕紅色水溶液,其濃度為215 g/ml1

將用5%NaOH處理好的D-101大孔樹脂裝填層析柱后,按文獻[4]方法進行毛茛皂苷的分離提取.將三次乙醇洗脫液合并后低溫旋轉蒸發濃縮至20 ml,得到棕紅色液體,其濃度為215 g/ml.

1.2.3 毛茛皂苷的鑒定與分析

采用泡沫試驗法鑒定毛茛皂苷[2]1

將上述制備得到的棕紅色液體(皂苷溶液)稀釋100倍,在波長為200～800 nm下紫外全程掃描,記錄其最大吸收峰的波長1以此最大吸收峰的波長為檢測波長進行高效液相色譜分析.用HNTX-Ⅲ為內標.

1.2.4 抑菌實驗

采用牛肉膏蛋白胨培養基培養9種供試細菌,將每一菌種均同時劃線接種于一個斜面培養基和兩個平板固體培養基上,37℃恒溫培養24 h1用藥敏紙片擴散法[5]對有效菌株的篩選,測定抑菌圈直徑;采用二倍稀釋法[6]測最低抑菌濃度(MIC)1

2 結果

2.1 毛茛皂苷的鑒定

經正丁萃取和經大孔樹脂吸附所得的棕紅色液體加熱煮沸約10 min后過濾于一試管中,劇烈振蕩,產生大量泡沫并長時間不消失(大于30 min),說明該液體含有高濃度皂苷.

2.2 毛茛皂苷的提取分析

對提取得到的毛茛皂苷在200～800 nm下紫外全程掃描顯示,其最大紫外吸收波長為209 nm(圖1).

經HPLC分析,內標HNTX-III和毛茛皂苷的HPLC各峰保留時間與各峰面積分別見圖2與圖3,其量化數據如表1所示.

圖1 毛茛皂苷的紫外掃描圖譜

圖2 內標和毛茛皂苷的HPLC峰保留時間圖譜

圖3 內標和毛茛皂苷的HPLC峰面積圖譜

從圖2、3與表1可見,正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品比樹脂吸附分離得到的毛茛皂苷粗品的成分要復雜,前者共有10個明顯的保留峰.根據各峰的保留時間,初步可推斷樹脂吸附分離得到的毛茛皂苷粗品HPLC中的1、2、3、4、5、6號分別對應正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品HPLC中的1、2、5、8、9、10號峰,說明正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品中還存在其他4種不同的雜質成分1根據峰面積大小基本判斷1號峰為毛茛皂苷的保留峰(主峰),正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品和樹脂吸附分離得到的毛茛皂苷粗品的HPLC中1號峰與內標峰的保留時間相近,且與內標1號峰的相對面積之比分別為0.1961和0.8789,可見正丁醇萃取毛茛皂苷收獲率是樹脂吸附分離毛茛皂苷收獲率的4148倍,且與毛茛皂苷粗品中其他成分比較,正丁醇萃取毛茛皂苷的純度整體大于樹脂吸附分離毛茛皂苷的純度.

表1 HPLC圖譜分析數據

2.3 毛茛皂苷的抑菌能力分析

利用HPLC對正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品進行多次純化得到較純凈的毛茛皂苷用作抑菌試驗1在選取的九種菌株中,毛茛皂苷對綠膿桿菌、糞腸球菌、產氣腸球菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用,測得其平均抑菌圈的大小與空白對照的比值分別為215、210、117、115(表2),而對其他5種細菌沒有明顯的抑制生長的效果.由此可知毛茛皂苷對綠膿桿菌抑制能力最大,其次分別是產氣腸球菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌.其中綠膿桿菌和產氣腸桿菌均為革蘭氏陰性菌,所以毛茛皂苷可能對革蘭氏陰性菌的抑制力大于對革蘭氏陽性菌的抑制作用.

通過二倍稀釋法測定了毛茛皂苷對篩選的4種有效菌株的最低抑菌濃度(MIC),實驗結果表明,毛茛皂苷對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為62.50 mg/ml,而對其他2種細菌的MIC都為31.25 mg/ml(表2).同樣可證明毛茛皂苷對綠膿桿菌和產氣腸桿菌生長的抑制作用比對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌生長的抑制作用要強.

表2 毛茛皂苷的抑菌效果

3 討 論

通過用正丁醇萃取法和大孔樹脂吸附分離法對毛茛皂苷提取含量和純度進行綜合比較,盡管大孔樹脂吸附分離法得到的毛茛皂苷樣品含雜質較少,但毛茛皂苷的相對含量不高,按HPLC峰面積計算,毛茛皂苷的峰面積與其他雜質總峰面積比為1.243(1079558/ 868502);相反,正丁醇萃取法得到的毛茛皂苷樣品含雜質成分個數雖然較多些,但毛茛皂苷的相對含量明顯較前者高,其與其他雜質總峰面積比為2.997 (4839328/1614965)1因此,正丁醇萃取對毛茛皂苷的提取率明顯高于大孔樹脂吸附的分離.而且,結合HPLC的多次純化,單位數量的原材料毛茛中可更多地收獲到較高純度的毛茛皂苷.然而,正丁醇萃取法需要耗費較多的劑試,提取成本較,且對環境有一定的污染.因而,如何更加有效地獲取毛茛皂苷還需更近一步研究.

抑菌結果顯示毛茛皂苷對綠膿桿菌、糞腸球菌、產氣腸球菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用,而對其他5種菌株沒有明顯的生長抑制性,說明其缺乏廣譜抑菌作用.然而,它對綠膿桿菌和產氣腸球菌的MIC都僅為31.25 mg/ml,明顯小于其他植物成分抑菌的MIC[6-8],表明它對綠膿桿菌和產氣腸球菌生長可能存在較特異的抑制作用,為其藥理藥學開發起到一定的提示作用1

參考文獻:

[1]王榕樂,譚毓治.毛茛總苷對血管緊張素Ⅱ致心肌肥大的影響[J].廣東藥學院學報,2008,24(2):154-156.

[2]陳曉青,蔣新宇,劉佳佳.中草藥成分分離分析技術與方法[J].北京:化學工業出版社,2006:180-202.

[3]蔡颯,李校坤.用血清藥理學方法觀察毛茛提取液對家兔主動脈平滑肌細胞內鈣的影響[J].中藥材,2004, 27(10):741-744.

[4]劉敏彥,王玉峰,葉曉紅.HPD300型大孔吸附樹脂分離純化白芍總苷的工藝研究[J].中國醫學雜志,2010, 30(3):201-204.

[5]National Committee for Clinical Laboratory Standards:Dilution antimicrobial susceptibility tests forbacteria thatgrow aerobically [J].Approved Standard:NCCLS document,1993:M7-A3.

[6]劉勝貴,陳鳩鳩,李軍,等.羊耳菊有機溶劑提取物的抑菌作用研究[J].遼寧中醫雜志,2010,37(3):398 -400.

[7]劉勝貴,彭斯文,閔丹.18種抗炎癥中草藥的抑菌作用研究[J].現代中醫藥,2007,27(2):41-43,70.

[8]樊明濤,陳錦屏.百里香提取物抑菌特性的研究[J].微生物學報,2001,41(4),499-504.

Abstract:Saponin was extracted and purified by D-101 macroporous resin adsorption and n-buoh alcohol extraction fromRnauneuusl.And saponin was analyzed through Uv,which indicate that its maximum absorption wavelength is 209 nm.As the same time,the purity and content of saponin which obtained by two different methods were tested by HPLC.The results showed that the effect of n-butyl alcohol extraction is better than that of the macroporous resin adsorbent.Then,the saponin was to be examined its preliminary bacteriostasis abilityon 9 different bacteria by measuring the size of the circle of bacteriostasis,the results showed thatsaponinhas the obviousbacteriostaticaction onBacillussubtilis,P.aeruginosa,E.faecalis,Gasaureus Staphyloccocus aureus Rosenbach.

Key words:saponin of Ranunculus japonicus; macroporous resin adsorption; n-butyl alcohol extraction; bacteriostasi

A Research on the Extraction of Saponin fromRnauneuusl and Its Preliminary Bacteria Functions

SU Bo
(School of Foreign Languages in Changsha,Changsha,Hunan 410001)

R284

A

1671-9743(2011)02-0053-04

2011-02-11

蘇 波(1969-),男,湖南岳陽人,湖南農業大學碩士生,主要研究環境生物學.