N，N′-二環(huán)己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數(shù)測定△

劉全軍,鄺曉聰,王聞楚,莫德歡,秦箐*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

化 學(xué)

N，N′-二環(huán)己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數(shù)測定△

劉全軍1,鄺曉聰2,王聞楚1,莫德歡1,秦箐1*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

目的：測定N，N′-二環(huán)己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數(shù)。方法：采用紫外分光光度法及A-pH曲線法測定N，N′-二環(huán)己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數(shù)。結(jié)果：紫外分光光度法測得N，N′-二環(huán)己基-N-二十二碳酸酰脲的pKa為7.16±0.24，A-pH曲線法求得pKa為6.98。

N，N′-二環(huán)己基-N-二十二碳酸酰脲；解離常數(shù)；紫外分光光度法；A-pH曲線法

N，N′-二環(huán)己基-N-二十二碳酸酰脲(DCHDU)為從板藍(lán)根中發(fā)現(xiàn)的板藍(lán)根高級不飽和脂肪酸為先導(dǎo)化合物合成的新化合物，完成了抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)的研究，從中篩選出的一個新化合物，經(jīng)免疫調(diào)節(jié)[1-3]及抗腫瘤[4]作用機制的研究顯示，化合物DCHDU在免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤方面更屬于結(jié)構(gòu)新穎的化合物，已申請相關(guān)專利。本文測定了化合物DCHDU的解離常數(shù)，是對該化合物理化常數(shù)的補充，并為化合物DCHDU進(jìn)一步藥學(xué)研究的開展提供依據(jù)。

解離常數(shù)常用的測定方法有電勢法、分光光度法[5,6]、電導(dǎo)率法、毛細(xì)管電泳法等。本實驗采用分光光度法測定了化合物DCHDU的解離常數(shù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，F(xiàn)E20pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。DCHDU(自制，純度>99%，GC測定)；其他試劑為分析純；水為雙蒸水。

1.2 緩沖液配制

稱取KH2PO42.443 8 g，KC1 27.924 6 g加入雙蒸水溶解后定容為1 L，取恒定離子濃度溶液(KH2PO4濃度為0.025 mol·L-1，μ=0.4)30 mL，滴加NaOH溶液(0.1,0.2 mol·L-1)，制得系列不同pH緩沖液。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法的選擇

DCHDU在甲醇溶液中在212 nm處有最大吸收峰，其紫外吸收光譜見圖1。

圖1 DCHDU紫外吸收光譜

分別以不同pH值的緩沖液為空白參比，在200～400 nm對DCHDU的不同pH值緩沖液進(jìn)行紫外掃描其紫外吸收光譜，見圖2。

圖2 不同pH緩沖液中DCHDU紫外吸收光譜

結(jié)果顯示pH 3.23～5.00 DCHDU的紫外吸收光譜行為一致，可認(rèn)為pH在5.00以下DCHDU呈分子狀態(tài)；在pH 10.57～11.26，DCHDU的紫外吸收光譜行為也一致，即完全呈解離狀態(tài)；而在pH 6.46～8.15的各種緩沖液中DCHDU存在不同的分子型和離子型。由于DCHDU在不同pH的緩沖液中的紫外吸收光譜存在較大差異，因此，可以利用分光光度法測定其解離常數(shù)。

2.2 測定方法

精密稱取DCHDU 12.5 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密量取500 μL溶液(共14份)，分別置5 mL容量瓶中，加入不同pH緩沖液定容，制得供試品DCHDU的濃度為12.5 μg·mL-1，室溫下測定供試品pH，并以相應(yīng)溶劑為參比，測定各供試品溶液的吸光度。

2.3 測定波長選擇

DCHDU的最大吸收峰位置隨pH的變化發(fā)生轉(zhuǎn)移，選擇在220，227，234，240 nm等波長下，樣品在離子狀態(tài)吸光度隨pH值的變化更為敏感，曲線變化更為明顯，故選擇這些波長對DCHDU的解離過程進(jìn)行研究。

2.4 讀數(shù)時間的選擇

按照測定方法選取加入不同pH緩沖液的供試品，進(jìn)行時間曲線掃描。結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH緩沖液中DCHDU紫外吸收時間掃描圖

表明DCHDU在不同pH緩沖液下，其吸光度隨時間逐漸增大，在離子和分子結(jié)構(gòu)同時存在的情況下其增大速度要快于只存在離子或分子的狀態(tài)，可能與酸堿條件下導(dǎo)致酰脲結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)。因此，選擇在溶液配制后5 min內(nèi)讀數(shù)。

2.5 測定結(jié)果及pKa的計算

按照上述測定方法，不同pH值供試品溶液分別在220，227，234，240 nm處測定吸光度，見表1。將表1中在同一波長的pH 6.16(AHR)、pH 10.57(AR-)及二者之間pH值(A)所測得的吸光度值代入公式pKa=lg(A-AR-)/(AHR-A)+pH，計算得pKa值，結(jié)果見表2。

表1 不同pH值DCHDU的吸光度

注：n=3

表2 DCHDU的解離常數(shù)

2.6 A-pH 曲線法作圖求pK值

根據(jù)公式pKa=lg(A-AR-)/(AHR-A)+pH，當(dāng)A=(AHR+AR-)/2時，所對應(yīng)的pH值即為pKa。在230 nm波長處測得DCHDU的吸光度，以A-pH作圖，得圖4所示曲線，以A=(AHR+AR-)/2點向橫坐標(biāo)做垂線，求得DCHDU的解離常數(shù)pKa為6.98。

圖4 234 nm處DCHDU的A-pH曲線

3 討論

酸堿解離常數(shù)(pKa)是藥物重要的ADME(吸收，absorption；分布，distribution；代謝，metabolism；及排泄，excretion)性質(zhì)之一，藥物的許多重要性質(zhì)都與pKa有著密切的聯(lián)系。比如解離常數(shù)(pKa)與藥物穿過細(xì)胞膜的過程有相關(guān)性，這對藥理研究和新藥開發(fā)都具有重要意義。

用紫外分光光度法測定物質(zhì)的pKa時，無需知道供試液中物質(zhì)的準(zhǔn)確濃度，只要求各供試液中物質(zhì)的濃度相等，但物質(zhì)的解離常數(shù)受緩沖體系、離子強度和有機溶劑的影響。本文選擇磷酸鹽緩沖體系并固定離子強度，因無水乙醇會使緩沖體系發(fā)生改變，故選用甲醇，以降低誤差。

[1] 秦箐，賀海平，Soren Brogger Christensen，等.中藥板藍(lán)根中高級不飽和脂肪酸的分離鑒定及免疫活性成分的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2001，11(1)：15-16.

[2] Yongzhi Wang , Qing Qin, Jibing Chen, et al. Synergistic effects of Isatis tinctoria L. and tacrolimus in the prevention of acute heart rejection in mice[J]. Transplant Immunology, 2009, 22: 5-11.

[3] Kong X , Chen J, Qin Q, et al. Isatis tinctoria L. combined with co-stimulatory molecules blockade prolongs survival of cardiac allografts in alloantigen-primed mice [J]. Transplant Immunology, 2010, 23: 34-39

[4] 王聞楚，秦 箐，高明星，等. N,N′-二環(huán)己基-N-山崳酸酰脲的合成及其抗腫瘤活性研究[J]. 廣東化工，2010，37(2)：48-49，71.

[5] 劉西京，楊大堅，羅潔英，等.紫外分光光度法測定葛根素的解離常數(shù)[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(11)：2206-2207.[6] 余 陳，何正標(biāo)，王 敏，等.雙波長分光光度法測定有機弱酸弱堿的解離常數(shù)[J].分析科學(xué)學(xué)報，2007，23(4)：401-404.

DeterminationofDissociationConstantofN,N′-Dicyclohexyl-N-DocosanoylUrea

LIU Quan-jun1, Kuang Xiao-cong2, Wang Wen-chu1, Mo De-huan1,Qin Qing1

(1.Dept.ofNaturalProductsChemistry,SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.Dept.ofPathophysiology,SchoolofPreclinicalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning, 530021,China)

Objective: To determine the dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea.Methods: The dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea is detected by ultraviolet spectrophotometry(UV) and A-pH curves.Results: The dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea is 7.16±0.24 by UV and 6.98 by A-pH curves.

N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea; Dissociation constant; Ultraviolet spectrophotry; A-pH curves

國家自然科學(xué)基金資助項目(30560186)，廣西科技廳廣西科學(xué)基金項目(桂科自0728128)，2007年廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目，廣西科技廳廣西科學(xué)基金項目(桂科自0991147)

*秦箐，E-mail：qqyx103@163.com

2010-12-01)