強直性脊柱炎患者外周血淋巴細胞亞群的檢測及其臨床意義

馬學華,張 萱,張 娜,趙 宇,宋麗婷

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科,黑龍江哈爾濱150001)

強直性脊柱炎(AS)是一種慢性自身免疫性疾病,主要累及髂骶關節、脊柱、骨軟骨組織及四肢關節,表現為脊柱和髂骶關節疼痛、活動障礙、畸形、關節強直而喪失勞動力。有學者研究表明外周血淋巴細胞比例失調見于系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥、原發性血小板減少性紫癜等自身免疫性疾病患者[1-3],并與疾病的發生密切相關,但淋巴細胞亞群與AS關系的報道卻不多見。本研究應用流式細胞術對AS患者外周血中淋巴細胞亞群進行檢測分析,以探討淋巴細胞與強直性脊柱炎發病的關系。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 2008年12月至2009年7月來我院就診的AS患者,參照1984年修訂的AS 36例診斷標準[1],符合以下3項標準:(1)腰痛持續3個月以上,活動后減輕,休息后無緩解;(2)腰椎額狀面和矢狀面活動受限;(3)腰廓活動度低于相應年齡、性別的正常人(＜2.5 cm);放射學標準髂關節炎為雙側≥Ⅱ級或單側Ⅲ-Ⅳ級或僅符合放射學標準。男25例,女11例,年齡15-32歲,平均年齡23.1±4.8歲。對照組32名,男性20例,女性 12例,平均年齡25.8±3.6歲,無自身免疫性疾病及骨關節病。

1.2 主要試劑及儀器 試劑美國BD公司生產的SimulSET IMK Plus試劑盒。其中包括CD45-FITC/CD14-PE,IgG1-FITC/IgG2a-PE,CD4-FITC/CD8-PE,CD3-FITC/CD19-PE,CD3-FITC/CD16+56-PE,CD3-FITC/HLA-DR-PE 6只熒光抗體;BD FACS紅細胞裂解液。用美國BD公司生產的FACSCalibur流式細胞儀檢測。

1.3 方法 抽取待檢患者清晨空腹靜脈血2 ml,EDTA-K2抗凝。6個試管中分別加入上述6種熒光標記抗體 20 μ l,每管 100 μ l全血 ,混勻 ,室溫避光靜置20分鐘,每管加入2 ml紅細胞裂解液,混勻后室溫避光反應10分鐘,1 000 r/min離心10分鐘,棄上清,每管加2 ml PBS洗滌,以300 μ l PBS懸浮細胞。首先用BD公司的CaliBRITE三色標準微球,通過FACSComp軟件自動校準流式細胞儀,激發光波長為488 nm,然后打開SimulSET軟件,獲取細胞,并分別報告出淋巴細胞亞群百分比。

1.4 統計分析 以t檢驗比較組間結果。

2 結果

2.1 AS患者及正常人外周血T淋巴細胞亞群比例

患者組外周血中CD3+CD8+T淋巴細胞與正常對照組外周血相比明顯降低(t=1.79,P＜0.05),CD4+/CD8+比值明顯升高(t=1.96,P＜0.05),CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞均有所升高,但無顯著性差異(P＞0.05)。結果見表1。

表1 AS患者T淋巴細胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

表1 AS患者T淋巴細胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

注:與對照組比較,*P＜0.05

組別 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+CD4+/CD8+AS組 66.9±9.0 36.4±5.5 39.0±9.0* 1.1±0.3*對照組 64.3±11.7 35.5±8.8 43.9±8.4 0.9±0.5

2.2 AS患者及正常人外周血B淋巴細胞、NK細胞及活化T淋巴細胞比例

CD3-CD19+B淋巴細胞明顯升高(t=2.437,P＜0.05),CD3-CD16+56+NK細胞明顯降低(t=1.83,P＜0.05),CD3+HLA-DR+活化T淋巴細胞明顯降低(t=2.40,P＜0.05)。見表2。

表2 AS患者B,NK及活化T淋巴細胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

表2 AS患者B,NK及活化T淋巴細胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

注:與對照組比較,*P＜0.05

組別 CD3-CD19+ CD3-CD16+56+CD3+HLA-DR+AS組 11.8±4.3* 21.5±9.6* 15.7±7.3*對照組 8.9±3.1 27.8±11.8 22.4±10.0

3 討論

T淋巴細胞是一種重要的免疫活性細胞,根據T細胞表面分子標志物的不同將其分成不同T細胞亞群。CD3代表全部T淋巴細胞,CD4是T輔助(Th)的表面標志,CD4+T細胞具有輔助T細胞轉變成效應細胞、B細胞轉化成漿細胞以及活化巨噬細胞等功能,在輔助、誘導細胞及體液免疫中發揮作用。CD8是抑制/殺傷 T細胞(Ts)的表面標志,CD8+T細胞具有細胞毒效應及抑制T細胞活化、抑制B細胞產生抗體、抑制細胞免疫及體液免疫的作用。機體的相對免疫平衡狀態主要由它們的相互影響來維持,兩亞群細胞比例的失調就會產生免疫功能失常,因此CD4+/CD8+比值代表了整體的免疫平衡[5]。本研究顯示,AS患者CD3+CD4+百分率升高,CD3+CD8+降低,CD4/CD8比例顯著升高,說明AS患者T細胞免疫失衡。AS患者的B淋巴細胞(CD3-CD19+)與對照組比較有明顯增高,提示B淋巴細胞在AS的發病機制中可能起到重要作用,與以往研究結果一致[6]。

NK細胞(CD3-CD16+56+)在抗病毒感染及抗變異細胞的早期起到決定作用,它們可通過釋放細胞因子如INF-γ來快速殺死異常細胞。同時,NK細胞在調節自身免疫反應中起重要作用,它主要通過釋放細胞因子對機體免疫功能加以調節,可抑制B細胞的分化和增殖,同時對T細胞介導的免疫功能起調節作用[7]。已有學者研究表明系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病患者外周血中NK細胞減少、功能受損[8]。本文發現AS患者NK細胞數量與對照組相比明顯減少,提示具有調節功能的NK細胞選擇性減少,不能有效調控自身免疫反應,導致 B細胞產生過多免疫球蛋白,可能為其發病的主要原因之一。該結果與Niva Azuz-Lieberman等人的研究結果相反[9],可能由種族或研究方法差異所致。

HLA-DR是淋巴細胞晚期的活化標志,AS患者CD3+HLA-DR+細胞明顯低于正常對照組,T細胞活化功能降低,致使抑制性T淋巴細胞不能發揮其抑制效應,從而導致B淋巴細胞增加及活化,產生大量自身抗體,導致疾病的發生。

本文表明,T淋巴細胞亞群的改變和NK細胞活性降低,導致B細胞功能亢進,產生多種自身抗體,在AS的發病機理中可能起到重要的作用。淋巴細胞亞群的改變會導致哪些細胞因子的變化、采用哪類細胞因子拮抗劑來治療AS還有待于進一步研究。

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[9]Niva Azuz-Lieberman,Gal Markel 1,Sa'ar Mizrahi 1,et al.The involvement of NK cells in ankylosing spondyliti[J].Int Immunol,2005,17(7):837.