冠心病相關基因多重單核苷酸多態性分型檢測法的構建

張陽東,溫新宇,董 矜,楚瑞雪,田亞平*

(1.解放軍第二炮兵總醫院 檢驗科,北京100088;2.解放軍總醫院 生化科,北京100853;3.解放軍第二炮兵禮士路門診部,北京100820)

近年來,隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變,冠心病(CAD)已成為當今危害我國人民健康和生命的主要疾病。CAD的基因機制及基因檢測在CAD診斷中的應用研究日益受到重視。單核苷酸的多態性(SNP)造成了人類在疾病易感性等方面的不同。SNP的基因型頻率、等位基因頻率及單倍體型頻率都可能與疾病相關。標簽SNP是指能代表一個染色體區域其他眾多位點信息的SNP位點。檢測SNP進行疾病的相關性分析,可以從遺傳的角度將疾病的基因診斷提高到單堿基水平。本研究通過提取人體外周血中白細胞的DNA,根據文獻及國際單倍型圖工程數據庫(Hapmap,http://www.hapmap.org)檢索,選擇中國漢族人群CAD相關基因內收蛋白1(ADD1),血小板內皮細胞黏附分子-1(PECAM-1),C-反應蛋白(CRP),內皮固有型一氧化氮合酶(ecNOS),漿細胞膜糖蛋白1(PC-1),L-選擇素(SELL),G蛋白β亞單位(GNB3),血管緊張素I轉換酶(ACE),血管緊張素II 1型受體(AT1R),血管緊張素原(AGT),細胞間黏附分子-1(ICAM-1),亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和肝脂肪酶基因(HL)等13個基因的44個標簽SNP,設計合成引物,應用SNP Stream基因分型系統構建檢測多重SNP的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 AG型PCR儀購自德國Eppendorf公司。SNP Stream基因分型系統購自美國Beckman Coulter公司。多重SNP檢測實驗所用dNTP購自日本TaKaRa公司,PCR緩沖液、氯化鎂、Gold Taq酶購自瑞士Roche公司,外切酶Ⅰ購自新英格蘭BioLabs公司,蝦鹼性磷酸酶及其緩沖液、滅菌雙蒸水購自美國Promega公司,余試劑購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 PCR引物的設計和合成 實驗相關的基因名稱、編碼,SNP編碼及突變類型見表1。

表1 SNP相關的基因、突變類型及樣本檢出率

應用美國Beckman Coulter公司的AP Editor軟件,在www.autoprimer.com上在線完成引物設計并由北京賽百盛基因技術有限公司合成。每個SNP共設計3個引物,其中2個為PCR擴增引物,用于擴增出含有目的SNP位點的片斷;1個為延伸引物,用于SNP位點的測序及與玻璃芯片上的寡核苷酸鏈雜交。SNP的PCR引物及延伸引物堿基序列見表2。

表2 SNP引物堿基序列

接上表

接上表

1.3 多重PCR擴增及純化 用滅菌雙蒸水將樣品DNA稀釋到2-10 ng/μ l。稀釋并混合PCR引物使其終濃度為2.5μ M,稀釋并混合延伸引物使其終濃度為5 μ M。96孔板的每個反應孔中加入由引物,dNTP,緩沖液,氯化鎂,Taq酶和滅菌雙蒸水構成的反應液3 μ l,對應每孔內加入稀釋后的樣品DNA 2 μ l,PCR總反應體積為 5 μ l。擴增條件:94℃變性1 min,然后進入40次循環(94℃變性30 sec,55℃退火30 sec,72℃延伸1 min),最后25℃保溫10 min。在擴增產物中加入3 μ l由外切酶Ⅰ、蝦鹼性磷酸酶和滅菌雙蒸水配制的純化液。純化反應條件:37℃30 min,96℃10 min,25℃10 min。

1.4 延伸 每個反應孔中加入7 μ l由延伸緩沖液,混合延伸引物,熒光標記的雙脫氧核苷酸T/C和A/G,DNA聚合酶和滅菌雙蒸水配制的延伸液。延伸反應條件:96℃3 min,進入40次循環(94℃20 sec,40℃11 sec),25℃保溫10 min。

1.5 洗板 吸取20倍稀釋后的沖洗緩沖液1(20X Wash Buffer 1)20 μ l加入到雜交板上的每個孔中,將雜交板翻過來放在無塵紙上,一起放在離心機的托盤內進行離心,使雜交板上每個孔中的清洗液全部脫離,離心速度為 1 000 RCF(2 665 r/min),每次離心1 min,一共洗滌3次。

1.6 雜交 在延伸產物中加入8 μ l雜交液,混勻后取15 μ l加入雜交板反應孔中,42℃雜交 2 h。1 000 RCF離心甩干。吸取20倍稀釋后的沖洗緩沖液2(60X Wash Buffer 2)20 μ l加入到雜交板上的每個孔中,離心甩干,一共清洗3次。

1.7 掃描 在SNPstream V2.2軟件中輸入與雜交板每個反應孔對應的樣品信息,導入引物位點文件并建板,掃描雜交板后通過該軟件分析掃描信號,校正偏離位點,調整基因型的邊界線并導出結果。

2 結果

2.1 SNP的結果掃描分析 延伸反應中SNP位點結合上熒光標記的雙脫氧核苷酸T(藍色)/C(綠色)和A(藍色)/G(綠色)后,通過雜交,經SNP Stream基因分型系統掃描,可以獲得三種顏色的掃描結果,即純合型的藍色(B)或綠色(G),雜合型的橙色。實驗中每份標本均設有1個陰性,2個純合型,1個雜合型共4個質控對照點。掃描圖的橫坐標為熒光強度相對值B/(B+G),縱坐標為熒光強度對數值。圖1所示5個掃描圖依次為陰性質控位點,純合XX型質控位點,雜合XY型質控位點,純合YY型質控位點和標本的SNP掃描結果。

圖1 SNP的掃描結果

2.2 反應體系中SNP的檢出率 反應體系由13個基因共44個SNP組成。通過對583份DNA標本進行檢測,共獲得12個基因32個SNP的基因分型結果,基因分型的成功率為72.7%。而分型成功的32個SNP的平均樣本檢出率為98.3%。SNP的樣本檢出率見表1。

3 討論

目前SNP的檢測方法主要有測序、高效液相色譜、限制性酶切、基因芯片和實時熒光定量聚合酶鏈反應等[1-3]。這些方法只能檢測一個或少數幾個SNP,不適合多個SNP、多種類型SNP和大批量標本的檢測。

美國Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系統是一套高自動化、高通量的SNP基因分型系統。它將多重PCR技術與熒光標記單堿基延伸分型技術結合起來。其基本原理是單堿基延伸和標簽微陣列。單堿基延伸法又稱微測序法,是在雙脫氧測序法的基礎上發展出來的SNP檢測方法。首先用PCR的方法從基因組DNA中擴增出含有目的SNP位點的片斷,用一條與SNP位點上游序列相匹配的引物進行“測序反應”,并在反應中加入熒光標記的雙脫氧核苷酸,使得這個“測序反應”在測出SNP位點的堿基后便終止了。雖然該方法基于測序原理,但由于只需測一個堿基,因而極大地提高了結果的準確性。該系統同時引入標簽微陣列芯片雜交技術,將寡核苷酸微陣列技術應用于常規的384孔板內。標簽微陣列是在玻璃芯片板的板底預先合成上幾十條交叉雜交率最低、與數據庫中各種基因組同源性極小,并能提供很強信號的單鏈寡核苷酸鏈(標簽),與這些標簽互補的帶有熒光標記的寡核苷酸鏈能通過雜交結合上去,然后掃描檢測其熒光標記。結果由成像儀根據標記的雙脫氧核苷酸的雙色熒光讀出,根據標簽標記的熒光不同,從而將與標簽互補的不同寡核苷酸鏈區別開。該系統不需要新的設備和試劑,只需要稍微改變實驗方法,就可以在同一實驗體系中同時對4種類型多至48個SNP位點進行大批量樣本快速檢測。目前該系統已廣泛應用于大樣本多SNP位點的檢測[4-6]。

本研究應用Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系統,在構建CAD相關基因多重SNP分型檢測法的實驗體系中共設計44個SNP的基因分型。實驗中發現2 ng的DNA就足夠進行44重SNP的檢測,即每個SNP位點只需要0.045 ng的DNA。由于不同基因擴增反應間引物的競爭及引物的融解溫度存在差異等影響因素,本實驗共獲得32個SNP的基因分型結果,基因分型的成功率為72.7%(32/44)。通過對583份DNA標本進行檢測,分型成功的32個SNP的平均樣本檢出率為98.3%。32個SNP包括C/T,A/G,G/T和A/C四種類型,每一類型均有較高的檢出率。總之,我們應用Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系統構建的32重SNP基因分型方法具有快速、準確、高通量、操作簡單、微量化并可同時檢測最多4種SNP類型等優點。

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