大鼠腦為底物間接免疫熒光法檢測谷氨酸脫羧酶抗體的研究

陳志英,白 梅,孟 和,其其格

(解放軍第253醫院,內蒙古呼和浩特010051)

谷氨酸脫羧酶(GAD)是抑制性神經遞質γ-氨基丁酸的合成酶。1990年Beakkeskov等首次證明是1型糖尿病(T1DM)的自身抗原。T1DM患者體內存在多種針對胰島自身抗原的抗體,以GAD-Ab、蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)及胰島素抗體(IAA)最為常見,其中GAD-Ab是最早出現的自身抗體[1]。測定血清GAD-Ab,首先要有抗原,作為GAD抗原的替代物有六種之多[2],鑒于容易獲取、成本低等優點,所以我室嘗試選擇大鼠腦組織做基質。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源 經臨床診斷符合WHO制訂的糖尿病診斷標準患者80例:32例1型糖尿病8-32歲,平均20.6歲;48例成人晚發隱匿性自身免疫性糖尿病18-44歲,平均36.9歲。正常對照組80例,選自體檢正常人群,年齡18-35歲,平均30.1歲。所有對象均于晨采空腹靜脈血,立即離心分離血清-80℃保存待測。

1.1.2 實驗試劑 FITC標記的兔抗人IgG抗體(上海生物制品所),GAD標準品(Sigma公司提供),BALB/c小白鼠腦印片,Wister大白鼠腦印片,正常人胰腺組織片;GAD-Ab檢測用ELISA試劑盒(進口分裝)(北京市福瑞公司提供)。

1.1.3 主要儀器 奧林巴斯萬能顯微鏡,培養箱。

1.2 實驗步驟 待檢血清標本1∶80(已知陽性)稀釋后滴加在抗原底物上,保濕37℃孵育40分鐘,洗滌后,滴加適當濃度的標記物工作液,保濕37℃孵育40分鐘,洗滌,封片鏡檢。均做平行測試。

1.2.1 ELISA檢測 嚴格按試劑盒說明書操作。

1.2.2 結果判讀 1∶80滴度待檢血清未見足量熒光標記物(≤10個/視野),則判為GAD-Ab陰性;否則為陽性-并記錄可測最高滴度。

1.2.3 統計學處理 率及例數分布用卡方檢驗,P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 標記物工作濃度確定 固定其他實驗條件,標記物工作液1∶200試驗結果最好。

2.2 最佳溫育時間 固定其他實驗條件,結果37℃40分鐘最佳。

2.3 試驗的特異性和靈敏度 試驗結果顯示試驗靈敏度97.5%(80例患者中檢出78例陽性);試驗特異性97.5%(正常對照組80例檢出2例陽性)。

2.4 方法比對

2.4.1 大白鼠腦、人胰腺抗原片檢測結果見表1。

表1 大白鼠腦、人胰腺抗原片檢測結果比較

2.4.2 與ELISA比較 ELISA檢測80例中陽性79例,陰性1例;本方法陽性 78例,陰性2例,r=0.996,兩種方法顯著正相關。

3 討論

已有研究表明:GAD-Ab在胰島素依賴性糖尿病(IDDM)發病前7-8年就可被檢出,而且發病后相當長的時間內持續存在,伴隨著胰島功能殘留而持續存在,這對IDDM預報提供了良好的幫助;對成人晚發隱匿性自身免疫性糖尿病的鑒別診斷具有重要價值。抗-GAD陽性患者中,由于體內存在自身抗體,與GAD結合后影響了GABA的合成速度,干擾了胰島素合成及分泌的調節,繼而使胰島β-細胞的功能受到影響,導致體內循環中胰島素之不足。我國昆明報道GAD-Ab在DM1患者陽性率61.3%,江蘇南通報道陽性率67.39%[4];河南新鄉報道陽性率41.7%(5/12)[3];新疆克拉瑪依地區報道陽性率為68.5%[5]。有研究者認為GAD-Ab預測DM1的特異性為100%,敏感性為82%;通過多因素分析排除年齡、性別和BMI的影響后:GAD-Ab陽性預示更差的胰島功能,由此提示測定GAD-Ab于DM1診療中的重要性。

目前在臨床實驗中,GAD-Ab的檢測有多種方法:中南大學湘雅二院周智廣等于1997年建立并于2004年進一步優化的“放射配體檢測法”;其他還有放射免疫法[6];酶免法[3];增敏化學發光免疫分析法[4]及斑點金免疫滲濾法等。鑒于大鼠腦GAD65和人GAD65的氨基酸序列具有高度同源性。本設計以大鼠腦為檢測底物,取代相對難獲取的人胰組織,建立改良的間接免疫熒光法,主要著染膠質細胞的胞質。該方法穩定性、重復性均好,與ELISA結果一致;特異性符合檢驗要求,而且價廉、簡便,易于推廣,特別適于1型糖尿病流行病學研究和初篩預報。

[1]Tisch R,Yang X D,Singer SM,et al.Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in nonobese dibetic mice[J].Nature,1993,1:72.

[2]李 霞,周智廣,黃 干,等.谷氨酸脫羧酶抗體水平對兩種成人自身免疫糖尿病的亞型的識別[J].中華內科雜志,2003,1:7.

[3]王衛民,張清貴,翁考剛,等.谷氨酸脫羧酶抗體和血、尿C肽在糖尿病中的臨床應用[J].中國醫藥導報,2008,5:61.

[4]周錦紅,劉振宗,王惠民.糖尿病檢測谷氨酸脫羧酶抗體,胰島細胞抗體和胰島素自身抗體的臨床意義[J].標記免疫分析與臨床,2006,3:145.

[5]于 帆,楊媛魁,王福剛,等,血清中三項抗體和胰島素在糖尿病分型中的意義[J].檢驗醫學與臨床,2008,5:289.

[6]李 旭,韓松濤.糖尿病患者餐后高血糖與谷氨酸脫羧酶抗體、β2-微球蛋白和HbAlc測定[J].北華大學學報,2008,1:37.