桑黃菌絲體多糖的分離純化及理化性質分析

謝麗源，張 勇*，郭 勇，吳 翔，彭衛紅，甘炳成

(1.四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.電子科技大學生命科學與技術學院，四川 成都 610054)

桑黃菌絲體多糖的分離純化及理化性質分析

謝麗源1，張 勇2,*，郭 勇1，吳 翔1，彭衛紅1，甘炳成1

(1.四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.電子科技大學生命科學與技術學院，四川 成都 610054)

研究桑黃粗多糖的分離和純化工藝，并對多糖組分進行理化性質分析。結果表明：經DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析得到兩個組分P-47000和P-8700；經高效液相色譜分析證明，兩組分均為純品，且不含蛋白質、核酸，為非淀粉類多糖，分子質量分別為4.74×104D和8.71×103D，均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖組成，P-47000中各單糖物質的量比為3.47:1.99:1:63.27:13.44，P-8700中各單糖物質的量比為10.46:1:1.03:182.75:30.94。

桑黃；多糖；純化；理化性質

桑黃是擔子菌亞門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)，非褶菌目(Aphyllophorales)，銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)，針層孔菌屬(Phellinus)的大型真菌，具有增強免疫、抗氧化、抗菌、消炎等藥理活性[1]。桑黃多糖是桑黃的主要功能成分，經過分離純化，得到相對較純的多糖才能更好地發揮作用，因此，桑黃多糖的分離純化是一個必不可少的步驟。而有關桑黃P. igniarius和P. linteus子實體多糖組成研究見諸報道[2-3]，但對桑黃P. baumii菌絲體多糖的分離純化及理化性質的報道還很少。由于不同的提取條件、分離純化手段以及不同的菌株，所得的糖組成結果不相同，因此通過分子質量檢測、單糖組成分析、紫外光譜掃描對桑黃P. baumii菌絲體多糖組分進行理化性質研究，旨在為進一步研究桑黃多糖構效關系提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃(Phellinus baumii)菌絲體粗多糖脫蛋白、脫色后干燥粉末，密封保存。

標準分子質量葡聚糖標準品(右旋糖苷：180～2000000D) 中國科學院成都分院分析測試中心；L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、肌醇、三氟乙酸 美國Sigma 公司；KBr(光譜純)、乙醇、甲醇、硫酸、苯酚、硼氫化鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、吡啶、乙酸酐、二氯甲烷、硫酸銅、碘液、三氯化鐵、酒石酸鉀鈉均為分析純 上海Sangon(中國)公司。

1.2 儀器與設備

HL-2N數顯恒流泵、SBS-100數控計滴自動部分收集 上海滬西分析儀器廠有限公司；真空冷凍干燥器 荷蘭Heto Drywinner；高效液相色譜系統(510型高壓泵，2410示差檢測器，Ultrahydrogel linear column 色譜柱) 美國Waters公司；GLI66-Ⅱ高速離心機 上海安亭科學儀器廠；UV1240紫外分光光度計 日本島津儀器公司；SC-6000氣相色譜儀 重慶川儀分析儀器有限公司；石英毛細管柱 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黃多糖分離與純化

1.3.1.1 DEAE-52纖維素柱層析

將經過脫蛋白、脫色的多糖樣品溶于適量的蒸餾水，離心去除不溶物，3mL上樣至離子交換層析柱(45cm×3cm， DEAE-52纖維素填充)，洗去不吸附組分，分別用蒸餾水、0.5、1、1.5、2mol/L NaCl 洗脫液分段梯度洗脫，恒流泵控制流速為2mL/min，自動部分收集器收集，每管收集5mL，苯酚-硫酸法檢測，繪制曲線，合并單峰部分，濃縮。

1.3.1.2 凝膠過濾層析

選用Sephadex G-100的凝膠填料，洗脫液為0.01mol/L磷酸緩沖液，柱規格為105cm×1.5cm，上樣量2mL，流速為0.5mL/min，每管收集4mL，苯酚-硫酸法檢測，繪制曲線，合并單峰部分，濃縮，干燥。

1.3.1.3 高效液相色譜(HPLC)純度鑒定

取測試純化多糖樣品少許，用流動相溶解，10000r/min離心10min，取上清液20μL進樣。色譜條件：流動相：1g/100mL NaCl溶液，流速0.6mL/min，記錄樣品色譜曲線。

1.3.2 桑黃多糖組分溶解性及顯色反應

觀察各組分的顏色、氣味、形狀、溶解性和碘反應、斐林試劑反應、三氯化鐵反應的現象。

1.3.3 桑黃多糖分子質量測定[4-5]

多糖在凝膠柱上的洗脫體積或保留時間與其分子質量密切相關，在一定分子質量范圍內，洗脫體積或保留時間與其分子質量的對數呈線性關系。根據這一性質，可用一系列已知分子質量的標準葡聚糖在一定色譜條件下制作分子質量的數值與保留時間或洗脫體積的標準曲線，根據待測多糖的保留時間，從標準曲線上求出該多糖的分子質量。標準葡聚糖(分子質量分別為2000000、133800、84400、41100、21400、10000、7100、4600、2500、180D)分別用 1g/100mL NaCl配制成溶液，10000r/min離心10min，上清液取20μL進樣，HPLC測定。以各標準多糖已知分子質量的對數對相應的保留時間作圖，得到標準曲線(由GPC數據處理系統完成)。分析條件：流動相 1g/100mL NaCl；流速 0.6mL/min。

1.3.4 桑黃多糖紫外光譜分析

稱取樣品少許，用蒸餾水配制成一定質量濃度的溶液，在波長200～400nm進行紫外全掃描。

1.3.5 桑黃多糖氣相色譜分析

1.3.5.1 色譜條件

氣相色譜儀(GC)配備SPB-1石英毛細管柱(28m×0.32mm，1.0μm)。FID檢測器，高純氮作為載氣，流速：30mL/min，進樣量為1μL，分流比為25:1；檢測器溫度為280℃，汽化室溫度為260℃，進樣口溫度為260℃；氫氣速度30mL/min，空氣流速200mL/min，尾吹(N2)速度30mL/min。程序升溫：柱初溫180℃，以2℃/min 升溫至 230℃[6-7]。

1.3.5.2 標準單糖樣品的酯化衍生制備

分別精密稱取5mg的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇，均勻混合后溶于1mL蒸餾水，加入15mg硼氫化鈉和5mg的肌醇作為內標物，在60℃還原1h。加乙酸分解過量的硼氫化鈉，至無氣泡逸出為止。減壓60℃蒸干，用甲醇反復洗，直至壁上為透明物質，真空干燥4h。將1mL吡啶和1mL乙酸酐加入到干燥的盛有還原糖樣品的反應瓶中，在100℃反應1h后，用1mL二氯甲烷萃取3次，合并3次萃取液后濃縮至1mL，待GC分析[8-11]。

1.3.5.3 樣品的酯化衍生制備

稱取10mg多糖樣品溶解在2mL的2mol/L三氟乙酸溶液中，密封100℃水解5h。離心，取上清水解液，減壓60℃蒸干。用甲醇反復洗，直至無酸味為止。水解糖樣溶解在1mL 0.05mol/L氫氧化鈉溶液中。以下操作同標準單糖樣品的酯化衍生制備。

1.3.5.4 GC分析及定量

用樣品按照以上方法處理后用GC測定。根據出峰時間，計算各糖組分的出峰面積，根據等物質的量的標樣組分，計算出樣品的物質的量比。

2 結果與分析

2.1 桑黃粗多糖DEAE-52纖維素柱層析

表1 桑黃粗多糖DEAE-52纖維素柱層析結果Table 1 Summary of chromatographic separation of crude deproteinized polysaccharides from Phellinus baumii mycelia on DEAE-52 cellulose column

圖1 菌絲體粗多糖DEAE-52纖維素柱層析Fig.1 Elution profile of polysaccharides from Phellinus baumiimycelia from DEAE-52 cellulose column

由表1、圖1可知，DEAE-52纖維素柱層析對桑黃粗多糖具有良好的分離效果，多糖的總回收率達到了89.2%。粗多糖經DEAE-52纖維素柱層析分離，階段洗脫，得到2個峰(組分Ⅰ和組分Ⅱ)，證明桑黃胞內多糖至少含有2種多糖組分。收集各單峰部分，經苯酚-硫酸法檢測，可知每個組分所占比例不同，蒸餾水洗脫組分Ⅰ占絕大部分，為77.1%，1mol/L NaCl洗脫也獲得一個組分Ⅱ，占22.9%。

2.2 桑黃多糖Sephadex G -100凝膠柱層析

為了得到均一多糖組分，繼續進行Sephadex G -100柱層析。取經DEAE-52纖維素柱層析純化獲得的上述多糖2mL，上樣到Sephadex G-100凝膠柱，用0.01mol/L磷酸緩沖液洗脫，進行進一步純化。由圖2、3可知，組分Ⅰ和組分Ⅱ經Sephadex G-100柱層析洗脫均得到一個峰 Polysaccharide-47000 (P-47000)和Polysaccharide-8700(P-8700)，其多糖回收率分別為81.3%和77.8%。

圖2 組分ⅠSephadex G-100 凝膠過濾層析Fig.2 Elution profile of fraction I from Sephadex G-100 gel filtration column

圖3 組分Ⅱ Sephadex G-100凝膠過濾層析Fig.3 Elution profile of fraction II from Sephadex G-100 gel filtration column

2.3 桑黃多糖純度鑒定

圖4 P-47000的HPLC圖譜Fig.4 HPLC profile of fraction I

圖5 P-8700的HPLC圖譜Fig.5 HPLC profile of fraction II

由圖4、5可知，兩組分多糖的HPLC色譜圖均呈現單一對稱吸收峰，表明從桑黃菌絲體中得到的兩個水溶性多糖組分均為單一多糖。

2.4 桑黃多糖物理性質

經冷凍干燥后的桑黃多糖P-47000為白色蓬松狀固體，P-8700為黃色晶體。兩者都可溶于水、稀酸、稀堿、稀鹽溶液，均不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑。兩種多糖與碘化鉀反應均不顯藍色，說明它們是非淀粉類多糖。兩種均一組分的斐林試劑反應、三氯化鐵反應均為陰性，說明它們不含單糖、多酚類物質。

2.5 桑黃多糖分子質量標準曲線及分子質量測定

以已知分子質量的標準葡聚糖(Mw)和保留時間(t)，制作標準曲線，得回歸方程：lgMw=11.94－0.552t+4.70×10-3t2－3.29×10-4t3(R2＝0.999)。根據保留時間從標準曲線回歸方程中求得各純化組分的平均分子質量，結果見表2。

表2 純化組分桑黃多糖的平均分子質量Table 2 Mean molecular weights of fractions I and II

2.6 桑黃多糖的紫外吸收光譜

對兩種均一多糖在波長200～400nm范圍內進行紫外全掃描，由圖6、7可知，P-47000和P-8700紫外全掃描圖譜非常相似，在波長280nm和260nm處均沒有吸收峰，說明兩種多糖組分均不含蛋白質和核酸。

圖6 P-47000紫外吸收光譜全掃描圖ⅠFig.6 UV full scan spectrum of fraction Ⅰ

圖7 P-8700紫外吸收光譜全掃描圖Fig.7 UV full scan spectrum of fraction Ⅱ

2.7 桑黃多糖中單糖組成及物質的量比

2.7.1 標樣GC分析

根據6種單糖混標的乙酸酯化衍生物的GC分析得圖8，混合標準糖樣品中各單糖的出峰順序為鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)。

圖8 混合標準糖樣中單糖的氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatograms of mixed monosaccharide standards

2.7.2 桑黃多糖中各單糖的GC分析

P-47000和P-8700水解、酯化的單糖組成氣相色譜與單糖標樣的氣相色譜圖比較可知，P-47000(圖9)和P-8700(圖10)中均含有5種單糖，對照混合單糖標準品的出峰時間，可判斷其含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖。

圖9 P-47000氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of fraction I

圖10 P-8700氣相色譜圖Fig.10 Gas chromatogram of fraction Ⅱ

根據出峰時間及其面積平均百分含量得出P-47000中鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖物質的量比為3.47:1.99:1:63.27:13.44，P-8700中鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖物質的量比為10.46:1:1.03:182.75:30.94。

3 討 論

本實驗采用離子交換層析分離桑黃胞內多糖，其多糖回收率高達89.2%，得到兩種多糖組分Ⅰ和組分Ⅱ，兩種多糖所占層析組分百分數分別為77.1%和22.9%，兩種多糖進一步經凝聚過濾層析分別得到多糖組分P-47000和P-8700，經凝聚柱層析和高效液相色譜驗證，兩種多糖均為均一多糖，說明DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-100凝聚過濾層析是該種桑黃胞內多糖分級純化的有效方式，并且為后續的活性和結構的研究奠定基礎。

從菌絲體中分離純化得到的兩個多糖組分P-47000和P-8700的外觀性狀不同，分別為白色蓬松狀固體和黃色晶體，均易溶于水、稀酸、稀堿、稀鹽溶液，均不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑；兩個多糖組分與斐林試劑反應、三氯化鐵、碘液反應呈陰性，表明不含單糖和多酚類及淀粉類物質；紫外光譜表明兩種均一多糖均不含核酸和蛋白質；從分子質量來看兩種均一多糖具有不同的分子質量，分別為4.74×104、8.71×103D。

對桑黃菌絲體多糖組分進行氣相色譜分析，由于糖類本身沒有足夠的揮發性，因此進行氣相色譜分析時，必須先將其轉化成易揮發、對熱較穩定的衍生物。采用先將糖還原為糖醇，再衍生為乙酸酯的方法，避免了衍生物異構體的產生，在進行色譜分析時每種糖都可以得到單峰，確保了測定結果的精確。由此可見利用氣相色譜法分析P. baumii菌絲體多糖單糖組成完全可行。通過氣相色譜分析表明，兩種均一多糖的單糖組成一致，由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖組成，其物質的量比不相同，P-47000中鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖物質的量比為3.47:1.99:1:63.27:13.44，P-8700中鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖物質的量比為10.46:1:1.03:182.75:30.94。

[1] 張小青, 戴玉成. 中國真菌志: 銹革孔菌孔: 第二十九卷[M]. 北京:科學出版社, 2005: 117-119.

[2] 秦俊哲, 劉華. 桑黃子實體多糖提取工藝及單糖組成研究[J]. 中國食用菌, 2008, 27(6): 43-45.

[3] 葛青, 張安強, 孫培龍. 桑黃子實體多糖的分離純化及單糖組成研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 291-294.

[4] 段金友. 肺葉多糖的分離純化、結構鑒定、生物活性與構效關系及碳水化合物方法學研究[D]. 北京: 中國科學院, 2003.

[5] 雷德柱. 灰樹花菌絲的深層發酵及其多糖的研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2001.

[6] 張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M] . 杭州: 浙江大學出版社, 1994:11-78.

[7] 李云捷, 吳謀成, 吳季勤, 等. 玉米花粉多糖的分離純化與結構鑒定[J]. 武漢生物工程學院學報, 2009(1): 25-27; 78.

[8] 徐桂云, 陳汝賢, 常理文. 用毛細管氣相色譜法測定多糖中單糖的組成[J]. 分析測試學報, 2000, 19(3): 71-73.

[9] ALBERSHEIM P, NEVINS D J, ENGLISH P D, et al. A method for the analysis of sugars in plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography[J]. Carbohyd Res, 1967, 5: 340-345.

[10] GE Qing, ZHANG Anqiang, SUN Peilong. Structural investigation of a novel water-soluble heteropolysaccharide from the fruit bodies of Phellinus baumii Pilat[J]. Food Chemistry, 2009, 114: 391-395.

[11] GE Qing, ZHANG Anqiang, SUN Peilong. Structural elucidation of a neutral fucoglucan from the fruiting bodies of Phellinus baumii Pilat[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89(2): 343-348.

Isolation, Purification and Physico-chemical Characteristics Analysis of Mycelial Polysaccharides from Phellinus baumii

XIE Li-yuan1， ZHANG Yong2,*，GUO Yong1，WU Xiang1，PENG Wei-hong1，GAN Bing-cheng1
(1. Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；2. School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, China)

The isolation, purification and physi-cochemical characterization of mycelial polysaccharides from Phellinus baumii were studied. Two polysaccharide fractions were separated from crude deproteinized polysaccharides from Phellinus baumii mycelia by DEAE-52 cellulose column chromatography, followed by purification on Sephadex G-100 gel filtration column. The two fractions were determined by HPLC to contain neither protein nor nuclear acid and to be pure non-starch polysaccharides,their molecular weights were 4.74×104D and 8.71×103D, respectively, and they were both composed of rhamnose, arabinose,xylose, galactose and glucose in a molar ratio of 3.47:1.99:1:63.27:13.44 and 10.46:1:1.03:182.75:30.94, respectively.

Phellinus baumii；polysaccharide；purification；physico-chemical characteristics

O636.1

A

1002-6630(2011)05-0143-05

2010-06-19

四川省青年基金項目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撐計劃項目(2008FZ0157)

謝麗源(1977—)，女，助理研究員，博士，研究方向為農產品加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：張勇(1977—)，男，副研究員，博士，研究方向為微生物。E-mail：zhangyong916@uestc.edu.cn