小腸結腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇

牛 蕾，祝長青,2，周光宏,*，徐幸蓮，李 彬，江 蕓

(1.南京農業大學 國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 200001)

小腸結腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇

牛 蕾1，祝長青1,2，周光宏1,*，徐幸蓮1，李 彬1，江 蕓1

(1.南京農業大學 國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 200001)

小腸結腸炎耶爾森菌作為一種食源性致病菌逐漸引起了關注。本實驗利用胰蛋白胨培養基、改良磷酸鹽緩沖液和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養基對小腸結腸炎耶爾森菌前增菌，并采用實時熒光PCR方法對增菌效果進行檢驗。結果表明：在純菌體系中胰蛋白胨培養基對小腸結腸炎耶爾森菌的增菌作用優于其他兩種培養基，并且增菌24h后即可檢測到該菌。在混菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌經過改良磷酸鹽緩沖液增菌后靈敏性最高，并且增菌時間可縮短至8h。因此在實際檢測中可采用改良磷酸鹽緩沖液對該菌進行增菌檢測。

小腸結腸炎耶爾森菌；前增菌；實時熒光PCR；培養基；食源性致病菌

小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)是一種革蘭氏陰性短桿菌。它在畜禽中含量較高，豬帶菌率最高。本菌是一種嗜冷菌，在0～4℃仍能繼續繁殖并產生毒素。在冰箱內存放的污染該細菌的食品對人仍具有感染性[1]。自20世紀80年代以來，小腸結腸炎耶爾森菌成為全球廣泛關注的一種要的食源性致病菌。1985—1987年我國從20 個省市的39412例腹瀉患者中檢出患小腸結腸炎耶爾森菌病例為256例，占0. 64%[2]。小腸結腸炎耶爾森菌所致疾病有回腸炎、腸系膜淋巴結炎、闌尾炎、結節性紅斑、關節炎、敗血癥和各種膿腫等[3]。

目前國內外各標準中規定的小腸結腸炎耶爾森菌的檢測方法均為傳統生化鑒定方法，此方法既耗時又需要大量的勞動力。實時熒光PCR方法由于具有實時監測反應進程、快速、特異性強以及靈敏性高等優點而成為目前檢驗該菌的主要方法[4-12]。但由于食品體系較復雜且雜菌率較高以致檢出率較低，所以在使用實時熒光PCR方法檢測小腸結腸炎耶爾森菌之前增菌是十分必要的。本實驗選取胰蛋白胨培養基(TSB)、改良磷酸鹽緩沖液(PSB)和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養基(ITC)3種培養基作為增菌液，分別在純菌體系和雜菌體系中對小腸結腸炎耶爾森菌進行前增菌，利用PCR方法對增菌效果進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

小腸結腸炎耶爾森菌標準菌株(CICC21565)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。陰性肉樣為市售肉制品。

PSB培養基、TSB培養基、CIN-1培養基、小腸結腸炎耶爾森菌生化鑒定套裝培養基 北京陸橋技術有限公司；ITC培養基及配套添加劑 青島海博公司。

DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；PCR預混液GoTaq Green Master Mix 美國Promega公司；Taqman探針預混液2×Premix Ex TaqTM大連寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Mastercycler PCR儀 美國Eppendorf公司；ABI7500實時熒光PCR儀 美國Applied Biosystems公司；LX-100手掌型離心機 江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；Anke TGL-16G 高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；WH-2 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；ZKSY-42智能恒溫水箱 南京科爾儀器設備有限公司；LD ZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；BIO-RAD凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 前增菌培養

1.3.1.1 純菌體系

取4.8×104CFU/mL小腸結腸炎耶爾森菌純菌液0.1mL分別接種于100mL PSB、TSB、ITC增菌液中，并置于26℃培養箱中培養48h。每隔8h取菌體沉淀一次，并取一定稀釋度的菌液0.1mL涂布于CIN-1選擇培養基上，置于26℃培養48h后進行計數。

1.3.1.2 雜菌體系

以480CFU/g肉樣為標準將小腸結腸炎耶爾森菌接種于10g陰性肉樣中，并將此肉樣分別置于裝有90mL PSB、TSB、ITC增菌液的三角瓶中，置于26℃培養箱中培養48h，每隔8h取菌體沉淀一次，取菌液劃線接種于CIN-1選擇培養基上，置于26℃培養箱中培養48h，另外將可疑菌落接種于小腸結腸炎耶爾森菌生化鑒定套裝培養基上進行生化鑒定。

1.3.2 DNA提取

取各時間點保留的菌體沉淀，參照天根生化科技有限公司細菌DNA提取試劑盒操作流程提取DNA。提取出來的DNA作為反應模板，以備后續PCR反應使用。

1.3.3 普通PCR反應

反應體系：GoTaq Green Master Mix預混液12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.75μL，模板DNA 2μL，雙蒸水補足體積到25μL。引物序列：上游引物ail-F為5＇-ACT CGA TGA TAA CTG GGG AG-3＇(664-683)，下游引物ail-R為5＇-CCC CCA GTA ATC CAT AAA GG -3＇(814-833)。引物由大連寶生物科技有限公司合成。

反應程序：95℃預變性5min；95℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸34s，共40個循環。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳

利用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，觀察目的基因擴增情況。

1.3.5 實時熒光PCR反應

反應體系：預混液2×Premix Ex TaqTM10μL (DNA聚合酶、反應用Buffer、dNTP、Mg2+等)，引物ail-F和ail-R (10μmol/L)各0.4μL，探針(10μmol/L)0.2μL，50×Rox Reference Dye Ⅱ0.4μL，模板DNA 2μL，雙蒸水補足體積到20μL。探針為FAM-TCG TTT GCT TAT ACT CAT CAGGGA - Eclipse (692-715)，其5＇-端標記報告基團為FAM，3＇-端標記淬滅基團為非熒光基團Eclipse。探針由大連寶生物科技有限公司合成。

反應程序：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火及延伸34s，共40個循環。

結果判斷：Ct值≥40，可判斷樣品結果為陰性，可直接報告未檢出相應致病菌；Ct 值＜40，可判斷該樣品結果為陽性。

2 結果與分析

2.1 傳統培養方法

表1 純菌體系中對小腸結腸炎耶爾森菌增菌不同時間后平板計數結果Table 1 The plate count of Yersinia enterocolitica after different cultivation time lg(CFU/mL)

如表1所示，在TSB培養基中該菌生長速度較快，PSB培養基是3種培養基中增菌效果較差的一種。在雜菌體系中通過對各培養基進行劃線分離，并進行生化鑒定，小腸結腸炎耶爾森菌生化鑒定結果如表2所示。在雜菌體系中檢驗結果顯示TSB培養基和PSB培養基經16h以上增菌 時間后均有陽性菌株被分離出來，但TSB 培養基檢出率不如PSB培養基高，而ITC培養基并未分離出小腸結腸炎耶爾森菌陽性菌株。

表2 雜菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification of Yersinia enterocolitica

2.2 普通PCR反應結果

圖1 純菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌經不同培養基及不同時間培養后PCR擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplified products of pure Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

如圖1所示，根據電泳條帶亮度可知在純菌體系條件下TSB培養基增菌效果較好，增菌 16h即可檢出該菌。在混合菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌目的基因擴增結果如圖2所示。從電泳條帶亮度可以看出PSB培養基在雜菌體系中增菌效果較好，且經16h增菌后即可檢測出該菌。但是由于瓊脂糖凝膠電泳靈敏度較低，所以各培養基具體前增菌效果需要通過實時熒光PCR方法進行驗證。

圖2 人工污染小腸結腸炎耶爾森菌后經不同培養基及不同時間培養后PCR擴增產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplified products of artificially contaminated Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

2.3 實時熒光PCR反應結果

圖3 純菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌經不同培養基及不同時間培養后實時熒光PCR擴增曲線Fig.3 Real-time PCR amplification curve of pure Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

根據實時熒光PCR原理，可以根據擴增曲線的Ct值判斷起始菌液濃度的高低進而得到各培養基的增菌效果。

由圖3可以看出，純菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌只有經過TSB培養基增菌后才有擴增曲線。

表3 純菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌經TSB培養基不同時間增菌后實時熒光PCR結果Table 3 Real-time PCR results of pure Yersinia enterocolitica in TSB medium after different cultivation time

由表3可知，8h和16h的Ct值明顯大于其他時間點的Ct值，所以小腸結腸炎耶爾森菌在經過TSB培養基增菌24h后可穩定的被檢測出來。

圖4 人工污染小腸結腸炎耶爾森菌經不同培養基及不同時間培養后實時熒光PCR擴增曲線Fig.4 Real-time PCR amplification curve of artificially contaminated Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

表4 人工污染小腸結腸炎耶爾森菌經不同培養基及不同時間培養后實時熒光PCR結果Table 4 Real-time PCR results for artificially contaminated Yersinia enterocolitica after different cultivation time and media

如圖4及表4所示，在雜菌體系中PSB培養基和TSB培養基均對小腸結腸炎耶爾森菌有增菌作用。但根據Ct值可知PSB培養基的增菌效果較好，并僅需8h即可檢測出該菌的存在。

3 結論與討論

經過普通PCR反應后，結果顯示純菌體系中TSB培養基是效果較好的增菌液。TSB培養基增菌8h后條帶較暗，這可能是由于小腸結腸炎耶爾森菌正處于延滯期，所以菌液中含菌量較低。然而PSB和ITC培養基增菌后并未有電泳條帶產生可能是由兩個原因所致：首先PSB對于小腸結腸炎耶爾森菌的增菌效果不如TSB好，這與計數結果一致；其次由于小腸結腸炎耶爾森菌在PSB培養基中為無色透明狀，所以很難獲得菌體沉淀從而致使提取DNA濃度較低。在雜菌體系中TSB培養基效果不如PSB培養基好，這可能是由于在TSB培養基中大多數細菌均適合增長，導致雜菌與小腸結腸炎耶爾森菌對營養物質形成了競爭關系。PSB培養基則選擇性較強，從而更適合小腸結腸炎耶爾森菌的增長。通過傳統培養鑒定的方法可以在雜菌系體系中分離出陽性菌株，從而排除了PCR反應假陽性結果的出現。

實時熒光PCR反應結果顯示，小腸結腸炎耶爾森菌處于純菌體系中時在TSB培養基中增菌效果優于其他兩種增菌液，并且增菌24h時即可穩定檢測。將該菌接種于陰性肉樣，用于模擬實際樣品檢驗時的雜菌體系環境，此時 PSB培養基的增菌效果好于TSB和ITC培養基，這與等[13]的研究結果基本一致，并且他還指出TSB培養基與PSB培養基相比更容易引起假陰性結果的出現。在小腸結腸炎耶爾森菌接種量為480CFU/g的肉樣雜菌體系中，使用PSB增菌液對小腸結腸炎耶爾森菌經過8h的增菌即可進行實時熒光PCR的檢測。

小腸結腸炎耶爾森菌毒力檢測基因包括：質粒上的黏附素基因(yadA)、毒力活化因子基因(virF)，染色體上的黏附侵襲位點基因(ail)、耐熱腸毒素基因(ystA)[14]。在這4種毒力基因中，質粒由于在菌種培養過程中易丟失，而Yst基因由于在多種致病菌中均出現而難以保證特異性檢測該菌，所以選定特異性較高的ail基因作為檢測目的基因。本實驗利用Nakajima等[15]設計的引物進行PCR擴增，該引物通過實驗結果顯示特異性較好進而極大的減少了假陽性結果的產生。在實時熒光PCR實驗中根據普通PCR中的引物選擇探針，本實驗探針3＇端使用的淬滅基團并非為通常采用的TAMRA基團，而采用了非熒光基團Eclipse。這種淬滅基團由于本身不產生熒光而降低了本底信號，可使反應的效率和可靠性增加。

隨著近年來多起食品安全事件的發生，食源性致病菌的檢測顯得尤其重要。傳統培養分離鑒定方法依然是檢測致病菌的主要方法，但其具有時間長、工作量大以及需要具有一定經驗的人員操作等特點。本實驗通過對小腸結腸炎耶爾森菌的前增菌方法的研究發現，利用PSB培養基對樣品進行8h前增菌，結合實時熒光PCR反應可快速準確地檢測致病性小腸結腸炎耶爾森菌。

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Selection of Pre-enrichment Methods for Yersinia enterocolitica

NIU Lei1，ZHU Chang-qing1,2，ZHOU Guang-hong1,*，XU Xing-lian1， LI Bin1，JIANG Yun1
(1. Nantional Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultual University, Nanjing 210095, China；2. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 200001, China)

Yersinia enterocolitica has been paid so much attention as a kind of foodborne pathogen. The pre-enrichment of Yersinia enterocolitica was conducted by using the cultivation in TSB, PSB and ITC media. The pre-enrichment effect was evaluated by real-time PCR. The results indicated that the cultivation in TSB medium was better than other two media for pure Yersinia enterocolitica system. The enrichment time was 24 h. In addition, an enhanced sensitivity and shorten enrichment time (8 h) of Yersinia enterocolitica were achieved in the mixed microbe system containing TSB and ITC. Therefore, PSB can be used in the detection of Yersinia Enterocolitica in samples.

Yersinia enterocolitica；pre-enrichment；real-time PCR；culture medium；foodborne pathogen

TS251.1

A

1002-6630(2011)05-0168-04

2010-05-13

國際科技合作項目——食品質量安全控制技術研究 (2009DFA31770)；國家自然科學基金項目(31071614)

牛蕾(1985—)，女，碩士研究生，主要從事肉品質量安全檢測研究。E-mail：hingis1985@126.com

*通信作者：周光宏(1960—)，男，教授，博士，主要從事肉品科學研究。E-mail：ghzhou@njau.edu.cn