AT-2滅活HIV-1病毒及純化回收鑒定

鮑琳琳，鄧 巍，孫麗華，高 虹，盧 葳，秦 川

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;2.法國巴黎第五大學腫瘤免疫治療研究中心)

AT-2滅活HIV-1病毒及純化回收鑒定

鮑琳琳1，鄧 巍1，孫麗華1，高 虹1，盧 葳2，秦 川1

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;2.法國巴黎第五大學腫瘤免疫治療研究中心)

目的 制備具備完整空間構型且純度在90%以上的滅活HIV-1病毒，用于HIV疫苗研究。方法應用化學制劑2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2;AT-2)滅活HIV-1病毒，對滅活的病毒超速離心濃縮并洗滌去除滅活用的化學制劑AT-2。采用分子篩技術去除滅活病毒中殘存的雜質蛋白質。結果 250 μmol/L AT-2與HIV-1 37℃作用1 h可以徹底滅活病毒的感染性，同時保留病毒的免疫原性。滅活的病毒純化后檢測不到AT-2的殘留，檢測牛血清蛋白殘余量低于50 ng/mL。結論 滅活的HIV-1病毒經過純化后純度達到95.6%，可以滿足作為HIV疫苗研究的免疫刺激劑的使用要求。

AT-2;滅活病毒;純化

傳統的病毒滅活方法有加熱滅活或者應用一定濃度的甲醛液滅活，這些方法通常會破壞病毒的空間結構從而改變病毒的抗原性，滅活的病毒多作為免疫原用于制備疫苗。HIV病毒在多年的研究中常采用加熱的方法滅活，滅活后的病毒與小片段的多肽在體外刺激試驗中比較，多肽具有更好的刺激活性，但是體內試驗的結果正好相反。造成這種結果的原因是多方面的，這與病毒的構型改變影響了滅活病毒的免疫原性有關。有文獻報道用化合物2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2，AT-2) 共價修飾HIV病毒核衣殼(NC)蛋白中的鋅指結構，從而滅活其感染性，這種滅活方法保持了病毒表面的病毒和宿主細胞來源的蛋白結構和功能的完整性。本研究是應用這種化學制劑將HIV-1病毒滅活，對滅活的病毒加以純化已達到能夠進行體內試驗的純度，為進一步研究HIV免疫機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病毒：HIV病毒來自于 HIV病人血漿，由PBMC細胞培養后收集上清液，存放于 -80℃保存備用。

1.1.2 主要儀器設備：XK16/70柱(Pharmacia GE)，GC-17氣相色譜儀，液相色譜儀(Bio-Rad)，酶標儀(Bio-Rad)，渦旋振蕩器 LDZ5-2，分析天平，AR1140萬分之一，低速離心機，生物安全柜，-80℃冰箱。

1.1.3 主要試劑及耗材：AT-2(Roche公司)，PBS，20%乙醇，Sephacry S-1000 super fine(Pharmacia GE)，30%丙烯酰胺混合液，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，10%過硫酸銨，分離膠緩沖液(1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCL緩沖液)，2×SDS凝膠上樣緩沖液，5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，轉膜緩沖液，10×TBS，TBS/T洗液，封閉液，底物液，SDS-PAGE蛋白電泳：采用Tris-甘氨酸-SDS-PAGE。羊抗人IgG辣根酶標記 (Jackson)，Mark Prestain protlander(Invitrogen)，ecl染色劑(中山公司)。PerkinElmer Life Sciences，Inc.，HIV-1 p24 ELISA試劑盒。定量檢測牛血清白蛋白酶聯免疫試劑盒(無錫博生醫用技術開發有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 滅活HIV病毒：使用二甲基亞砜將AT-2的濃度調配到250 μmol/L，在37℃條件下，將溶解的AT-2滴加入待滅活的HIV病毒，邊滴加邊搖勻。滴加完畢后在37℃條件下反應1 h［3］。

1.2.2 滅活效果測定：RPMI 1640培養液(含10%牛血清)中加入PHA，將配好的培養基加入PBMC細胞中，置CO2培養箱培養過夜。次日用PBS洗細胞1次。細胞中加入RPMI 1640培養液(含 IL-20 U/mL)，放CO2培養箱。4 d后接種滅活的 HIV病毒。接種病毒后觀察 2 周，4、6、9、12、14 d 取樣品上清作病毒載量測定。

1.2.3 濃縮及洗滌滅活病毒：將滅活的 HIV病毒已超速離心的方法濃縮洗滌，100 000 g(29 300 rpm)4℃離心2 h。離心3次洗滌 HIV滅活病毒。

1.2.4 純化滅活 HIV病毒：XK16/70(140 mL，70 cm柱長度凝膠層)，應用這種分子篩對滅活HIV病毒進行純化。聚丙烯酰胺葡聚糖超微凝膠(Sephacryl S-1000 Super fine)裝填于XK16/70的柱子中并用PBS平衡柱子，調基線使基線為零。上藍色葡聚糖-2000(大分子量分子全排阻)，觀察裝柱情況，如藍色葡聚糖均勻穩定成一條基線向下移動證明柱子已裝好。用PBS將葡聚糖沖出。上樣，加5 ml的滅活HIV病毒進入柱子，并用液相色譜儀記錄，收集峰值的液體，同時用 PBS洗脫。同時測定回收液280 nm的A值，確定回收的溶液中的總蛋白含量。

1.2.5 AT-2殘余量測定：氣相色譜分析：用移液器精密量取對照品100 μL，置于10 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為1號標準溶液，濃度為 10 μg/mL，再用逐步稀釋法，配成 8、6、5、4、2、1 μg/mL的系列標準溶液，按照色譜條件進樣分析，以峰面積與濃度作標準曲線。用“金羊工作站”提供的統計軟件進行結果分析。

1.2.6 殘余牛血清測定：應用ELISA的方法檢測滅活HIV病毒中牛血清含量，根據藥典第三部要求作為抗原刺激劑的生物制品牛血清殘留量不超過50 ng/mL。

1.2.7 抗原含量測定：用ELISA方法進行P24測定。

2 結果

2.1 HIV病毒滅活效果

AT-2滅活后的HIV-1病毒和未滅活的 HIV-1病毒分別加入到PBMC細胞中，在接種后的第4、6、9、12、14天取出一半的溶液作病毒載量測定。測定結果顯示，滅活的病毒在PBMC細胞中沒有增殖，證明病毒已經被徹底滅活。結果見圖1。

圖1 病毒載量變化，AT-2：AT-2滅活的Note： AT-2： AT-2 inactivated HIV-1 virus;HIV-1：HIV-1 virus controlFig.1 Viral loading in days

2.2 滅活病毒濃縮及洗滌的效果

滅活的HIV-1病毒超速離心，后經過3遍洗滌體積濃縮了100倍。RT-PCR檢測滅活HIV-1病毒載量，滅活病毒比超離前濃縮了50倍，回收率在51%左右。氣相色譜分析的方法檢測MT-2在滅活HIV-1病毒中的殘余量，AT-2殘留量在氣象色譜檢測的域值以下，即檢測不到滅活劑的殘留。滅活病毒洗滌前、后的變化見表1。

表1 滅活病毒洗滌前后比較Tab.1 Results of ultracentifugation of the inactived HIV-1 virus

2.3 對純化前、后的樣品進行蛋白含量測定

A280nm測定峰1回收液中蛋白含量為：0.022 mg/mL;峰2回收液中蛋白含量為：0.001 mg/mL。根據液相色譜分析圖顯示圖2，兩個峰已經完全分開，根據蛋白量計算純度為95.6%。

2.4 抗原回收率及純化結果

對幾次純化結果進行了滅活病毒P24測定，各次結果都很接近，重復性較好。按滅活病毒原液量、純化后的滅活病毒收液量及其P24濃度進行計算，滅活病毒的平均回收率為74%。柱層析后牛血清蛋白清除率為99%以上，純化后的樣品中牛血清蛋白殘留含量＜50 ng/mL。滅活病毒純化蛋白含量及回收率結果見表2。

圖2 滅活HIV Sephacry S-1000柱層析圖譜Fig.2 Sephacry S-1000 column chromatographic profile of the purified inactived HIV virus.

表2 滅活病毒純化蛋白含量及回收率Tab.2 Results of ultracentifugation of the inactived HIV-1 virus

3 討論

一些被滅活的完整病毒顆粒已成功應用于疫苗研制，但以前的滅活方法可使病毒蛋白變性，免疫原性降低使滅活的病毒失去了作為免疫刺激劑的基本結構。一接種疫苗后，值得注意的是，一些疫苗促進了疾病的發展而非起到保護作用。我們用化合物 2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2;AT-2)共價修飾人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核衣殼(NC)蛋白中的鋅指結構［4，7］，從而滅活其感染性。滅活病毒在體外不易發覺感染性。和常規方法加熱或甲醛液處理滅活的病毒相比，保持了病毒表面的病毒和宿主細胞來源的蛋白結構和功能的完整性。AT-2滅活病毒其結構和功能的完整性的維持表明這種病毒可能是有效的疫苗抗原［3，5-9］。我們的研究也證實了這種化學方法滅活的的病毒是被徹底滅活的，病毒不再具有感染性和復制能力。

滅活的HIV-1病毒用作體內試驗的免疫刺激劑，對于其純度有一定要求。其中混在的在蛋白在一定程度上會影響滅活病毒的免疫效果。基于這種要求，對于滅活的病毒做了純化和濃縮的處理。滅活HIV病毒經過超速離心濃縮后過Sephacry S-1000凝膠柱純化，99%以上的雜蛋白及殘留牛血清被除去。滅活病毒回收率為74%左右。總蛋白含量的減少說明純度的提高，達到了純化的目的。凝膠過濾層析是層析技術中最簡單、條件最溫和，對保持生物大分子的活性最有力的方法。純化后的滅活病毒純度在95.6%，已經可以滿足體內試驗的要求，為做HIV-1病毒免疫機制研究以及研發疫苗做準備。

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AT-2-Inactivation of HIV-1 Virus and Its Purification and Identification

BAO Lin-lin1，DENG Wei1，SUN Li-hua1，GAO Hong1，Louis LU2，QIN Chuan1
(1.Center of Comparative Medicine，Institute of Laboratory Animal Science，CAMS＆ PUMC，Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China，2.Institut de Recherche sur les Vaccins et l’Immunotherapie des Cancers et Sida，Universite Rene Descartes(Paris V)，Paris，France)

Objective To prepare an inactivated HIV-1 virus with configurational integrity and more than 90%purity for HIV vaccine research.Methods HIV-1 virus was inactivated by 2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2，AT-2)with complete immunogenicity.Ultracentrifugation and washing was conducted to remove the chemical reagent used for virus inactivation.The residual impurity proteins in the inactivated virus was removed by molecular sieve technology.Results For chemical inactivation，HIV-1 virus was treated with 250 μM AT-2 for 1 h at 37℃ .Chemically inactivated noninfectious SIV with conformationally and functionally intact envelope glycoproteins was produced by treatment with AT-2 as described elsewhere［1-2］.No AT-2 residue was detected in the purified inactivated virus.Residual bovine serum albumin was detected less than 50 ng/mL.Conclusions In this study HIV-1 virus was successfully inactivated with AT-2 and reached a purity of 95.6%.It can meet the requirements as an immune stimulating agent in HIV vaccine research.

AT-2;Inactivation，virus;Liquid chromatography;Purification

R33

A

1671-7856(2011)04-0021-03

2010-09-29

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.005

科技重大專項-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治：2009ZX10004-307;衛生公益性行業科研專項項目：200802036;中央級公益性科研院所基本科研業務費：DWS200810。

鮑琳琳，助理研究員，研究方向：艾滋病免疫治療。

秦川，教授，博士生導師，Email：chuanqin@vip.sina.com。