烏司他丁對機械通氣致肺損傷大鼠肺組織CC16表達的影響

王曉艷，張新日

(1.山西醫科大學，太原 030001;2.山西醫科大學第一醫院呼吸科，太原 030001)

烏司他丁對機械通氣致肺損傷大鼠肺組織CC16表達的影響

王曉艷1，張新日2

(1.山西醫科大學，太原 030001;2.山西醫科大學第一醫院呼吸科，太原 030001)

目的 通過觀察烏司他丁(UTI)對大潮氣量機械通氣大鼠肺組織Clara細胞分泌蛋白(CC16)表達的影響，探討CC16在機械通氣所致肺損傷(VILI)發病中作用以及UTI對VILI的干預作用。方法 24只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、大潮氣量組和UTI干預組，觀察其肺組織病理學改變，測定肺組織中丙二醛(MDA)和BALF中總蛋白(TP)含量，采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測肺組織CC16 mRNA的表達，采用免疫組織化學染色法檢測肺組織中CC16蛋白表達及Clara細胞計數。結果 與對照組比較，大潮氣量肺組織MDA的含量及BALF總蛋白含量明顯升高(P＜0.01)，而肺細支氣管上皮細胞CC16mRNA及其蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01);與大潮氣量組比較，UTI干預組大鼠肺組織中MDA的含量及BALF總蛋白含量明顯降低(P＜0.01)，而肺細支氣管上皮細胞CC16mRNA及其蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01)。結論 大潮氣量機械通氣導致肺組織CC16 mRNA及其蛋白表達水平降低在VILI發病中起重要作用，烏司他丁不但能促進Clara細胞分泌CC16而抑制肺組織炎癥反應，還能抑制脂質過氧化物的產生，對VILI有一定保護作用。

機械通氣;急性肺損傷;CC16;烏司他丁

大量研究表明，多種炎癥介質和細胞因子參與了機械通氣所致肺損傷(VILI)的發病過程，其機制仍不十分清楚。近年來研究發現，Clara細胞分泌蛋白——CC16具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等多種生物活性，但其是否參與VILI的發病過程目前尚未見到文獻報道。烏司他丁(UTI)是一種廣譜蛋白酶抑制劑，能抑制炎癥介質和氧自由基的產生和釋放，在臨床上主要用于DIC、休克和急性胰腺炎等疾病的治療，但有關UTI對VILI時炎性介質和細胞因子影響的研究報道甚少。本文擬通過動物實驗觀察大潮氣量機械通氣大鼠肺組織CC16的表達水平，以及UTI對其表達的影響，探討UTI對VILI的干預作用。

1 材料和方法

1.1 動物分組及模型制備

取成年雄性 Wister大鼠24只(山西醫科大學實驗動物中心提供，清潔級 合格證號：SCXK2009-0001)，體重300～380 g，隨機分為3組：①對照組：未行機械通氣;②大潮氣量組：VT30 mL/kg，通氣前3 d開始每天上午及通氣后1小時經腹腔注入生理鹽水3 mL;③烏司他丁(廣東天普生化醫藥股份有限公司產品)組：VT30 mL/kg，通氣前3 d開始每天上午及通氣后1 h經腹腔注入UTI 3 mL(10萬U/kg)。

25%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開。除對照組外，其余各組大鼠均通過三通管與動物人工呼吸機(DH-150型，浙江大學醫學儀器廠制造)相連接行機械通氣。各組大鼠的通氣參數除潮氣量外，其余參數均相同，即 RR：60次/min，I/E：1/3，FiO2：21% 。通氣時間為 120 min。

1.2 BALF及肺組織標本采集與處理

通氣結束后經腹主動脈放血處死大鼠，暴露氣管及肺臟，結扎右主支氣管，用生理鹽水反復灌洗左肺(4 mL×3次)，灌洗液(BALF)回收率達75%以上。將收集到的 BALF離心(3 000 r/min，10 min，r=10 cm)后。取上清液 -20℃凍存待檢。取部分右肺組織，用10%的甲醛固定，常規石蠟包埋、行HE染色和免疫組織化學染色。另取部分新鮮肺組織，-70℃保存，用于提取肺組織總RNA以及測定肺組織MDA含量。

1.3 肺組織MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸比色法測定大鼠肺組織中丙二醛(MDA)含量。測定方法及操作步驟按試劑盒說明進行，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 BALF中總蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍染色法測定BALF中總蛋白含量，操作步驟按試劑盒說明進行，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 肺組織CC16免疫組織化學染色及Clara細胞計數

采用鏈霉素親和-生物素-過氧化酶復合物(SABC)法測定大鼠肺組織CC16蛋白表達，具體操作步驟參照試劑盒說明(試劑盒購自北京博奧森生物有限公司)進行。兔抗大鼠抗體工作濃度為1：50，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

結果判斷：陽性染色為細胞胞漿呈棕黃色，染色陽性細胞即為Clara細胞。在400倍光鏡下對每張組織切片隨機選取5個視野進行觀察。采用BI-2000醫學圖像分析系統檢測每個視野的光密度值，以上述5個視野的平均值作為該大鼠肺組織CC16蛋白表達的相對含量。在高倍鏡下(×400)對每張組織切片隨機選擇4個終末或呼吸性細支氣管，計算Clara細胞占細支氣管上皮細胞總數的百分比。

1.6 肺組織CC16mRNA測定

肺組織CC16mRNA水平的檢測依照一步法RT-PCR試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)操作指南，以提取的大鼠肺組織總RNA作為模板，上游引物：5′-tgaagaggctggtggatacc-3′，下游引物：5′-ttggtgtagggaggtcaagg-3′。反應條件為：反轉錄50℃，30min，滅活 反轉錄 酶 94℃，2min，預 變性94℃，30s，54℃ 退火、延伸 72℃，4 min，共 32 個循環。內參照為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，上游引物：5′-tgaacgggaagctcactgg-3′，下 游 引 物： 5′-tccaccaccctgttgctgta-3′。擴增產物在 2%瓊脂糖凝膠(0.5μg/mL溴化乙錠)中進行電泳，片段分別為185 bp和307 bp，用Bio-Rad凝膠數字成像系統進行掃描分析，mRNA相對含量由CC16與GAPDH吸光度值×面積的比值表示。

1.7 統計學方法

全部數據用SPSS13.0軟件包進行統計分析，數據以ˉx±s表示，組間差異比較采用方差分析法，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

表1 各組肺組織MDA含量及BALF中總蛋白含量(ˉx±s)Tab.1The levels of MDA in the lung and total protein in BALF groups(ˉx±s)

2 結果

2.1 大鼠肺組織HE染色結果

HE染色高倍鏡下觀察，對照組肺泡結構和各級支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯炎癥細胞浸潤。大潮氣量組可見彌漫性肺間質水腫和大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內有少量出血，UTI組可見肺間質水腫和少量炎性細胞浸潤，肺泡腔結構基本完整，肺損傷程度較大潮氣量組明顯減輕(圖1～3見封二)。

圖7 各組CC16、GAPDH mRNA電泳圖M：marker;A：UTI pretreatment group;B：High tidal volume ventilation group;C：Control groupFig.7 Electrophoresis figure of CC16mRNA and GAPDH mRNA in groups

2.2 肺組織MDA含量和BALF總蛋白含量測定

各組大鼠肺組織MDA和BALF總蛋白含量測定結果見表1。結果顯示：大潮氣量組大鼠肺組織MDA含量和BALF總蛋白含量明顯高于對照組和UTI干預組(均 P＜0.01);UTI干預組大鼠肺組織MDA含量和BALF總蛋白含量雖高于對照組，但較大潮氣量組明顯降低(均P＜0.01)。

2.3 肺組織CC16mRNA及其蛋白表達及Clara細胞百分比測定

各組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白及Clara細胞百分比測定結果見表2和圖4～7(圖4～6見封二)。結果顯示：大潮氣量組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白表達及Clara細胞百分比明顯低于對照組和 UTI干預組(均 P＜0.01);UTI干預組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白表達及Clara細胞百分比雖低于對照組，但較大潮氣量組明顯增高(均 P＜0.01)。

3 討論

呼吸機所致肺生物傷或炎癥性損傷是機械通氣的嚴重并發癥，也是當今醫學界研究的熱點和難題。近年來研究發現，Clara細胞分泌蛋白——CC16具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調節及抑制腫瘤生長、轉移等多種生物學活性，但其是否參與VILI的發病過程目前尚未見到文獻報道。

Clara細胞是排列在肺細支氣管黏膜上的一種非纖毛上皮細胞，具有分泌功能。1881年，Kolliker首先發現了這類細胞。1937年Max Clara描述了這類細胞的形態特征，同時以他的名字命名。Clara細胞分泌的主要物質之一是Clara細胞分泌蛋白(CCSP)，因其相對分子量為 15840，故稱為 CC16。近年來隨著對 CC16研究的不斷深入，人們發現CC16不但具有抗炎、抗氧化、調節免疫等多種生物功能，而且與急性肺損傷的發生、發展有密切關系，是肺組織特異性表達的一種內源性抗炎因子。

表2 各組肺組織CC16mRNA及其蛋白及Clara細胞百分比(ˉx±s)Tab.1The expression of CC16 and protein in lung and the percentage of Clara cells in groups(ˉx±s)

目前認為CC16是急性肺損傷的一個新的生物標志物［1］。急性肺損傷時細胞內 NF-кB常發生活化，NF-кB活化后可上調多種細胞因子，如 TGF-β1、TNF、IL-8等的表達，但對 CC16基因轉錄卻具有抑制作用，導致Clara細胞中CC16含量減少［2］。CC16減少后削弱了對 PLA2的抑制作用［3］，使花生四烯酸類促炎細胞因子生成增多，導致炎癥細胞大量聚集活化，分泌大量炎癥介質而引起肺組織損傷。實驗研究發現［4］，CC16缺陷大鼠在感染病毒或接受抗原刺激時比野生鼠表現出更強的炎癥反應，而給予重組人 CC16后其炎癥反應可明顯減輕，說明CC16在抗炎作用中扮演著重要角色。本研究結果顯示，大潮氣量組大鼠肺組織可見彌漫性肺間質水腫和炎癥細胞浸潤，BALF總蛋白含量明顯高于對照組，而肺組織CC16mRNA及其蛋白表達水平明顯低于對照組，提示大潮氣量機械通氣所引起的急性肺損傷與CC16表達減少有一定關系。因此，通過上調CC16的表達可抑制肺組織炎癥細胞發生活化，減少炎癥介質的釋放，對VILI應具有保護作用。

烏司他丁是一種廣譜酶抑制劑，能穩定溶酶體膜，抑制溶酶體酶釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質的釋放，近年來廣泛用于ALI/ARDS的治療，收到一定效果。譚朝華等［5］通過對油酸致急性肺損傷動物模型研究發現，烏司他丁對脂質過氧化物的產生具有明顯抑制作用。Okumura等［6］研究發現，UTI不但能抑制脂質過氧化物的產生，還能抑制PMN在肺組織內聚集活化。Abe等［7］研究發現，UTI可通過上調抗炎因子(IL-10)的表達和清除肺組織內氧自由基而發揮抗損傷作用。本研究結果顯示，UTI干預組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白表達水平明顯高于大潮氣量組，而肺組織 MDA含量和BALF總蛋白含量較大潮氣量組明顯減少，同時肺組織充血、出血、滲出和炎癥細胞浸潤等病理損傷改變亦明顯減輕，說明UTI對VILI具有一定防治作用。其機制包括兩方面：①通過上調CC16的表達而抑制炎癥細胞在肺內聚集、活化和釋放炎癥介質;②通過抑制脂質過氧化反應而減少肺內氧自由基的產生。

綜上所述，肺組織Clara細胞數量及CC16含量減少與VILI發生、發展有密切關系。UTI一方面可通過促進CC16的合成而抑制肺組織炎癥反應，另一方面又可通過抑制氧自由基的釋放而減輕肺組織氧化性損傷，因而對 VILI的臨床防治具有積極作用。

［1］ McAuley DM，Belfast UK，Michael A，et al.Clara cell protein CC16 a new lung epithelial biomarker for acute lung injury［J］.CHEST，2009，135(6)：1408-1410.

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［3］ Yoshikawa S，Miyahara T，ReynoldsSD，etal. Clara cell secretory protein and phospholipase A2activity modulate acute ventilatol-induced lung iniury in mice［J］.J Appl physiol，2005，98(4)：1264-1271.

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［6］ Okumura Y，Inoue H，Fujiyama Y，et al.Effects of serine protease inhibitors on accumulation of polymorphonuclear leukocytes in the lung induced by acute pancreatitis in rats［J］.J Gastroenterol，1995，30：379.

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Effects of Ulinastatin on the Expression of Clara cell Secretory Protein(CC16)in the Rat Lung in High Tidal Volume Mechanical Ventilation

WANG Xiao-yan1，ZHANG Xin-ri2
(1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.Department of Respiratory Medicine，First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective To explore the role of ulinastatin(UTI)in the treatment course of ventilator-induced lung injury(VILI)by investigating the effect of UTI on expression of Clara cell secretory protein(CC16)in the lung of rats in high tidal volume mechanical ventilation.Methods Twenty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups：control group，high tidal volume ventilation group and UTI pretreatment group.The levels of MDA in the lung and total protein in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured.The expression of CC16 mRNA in the lung was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The number of Clara cells and synthesis of CC16 were detected by immunohistochemistry.Results Comparing with the control group，the levels of MDA in lung and total proteinin bronchoalveolar lavage fluid were very significantly increased(P＜0.01)in the high tidal volume ventilation group，and the expression of CC16 was significantly decreased(P ＜ 0.01).Comparing with the high tidal volumeventilation group，the levels of MDA in the lung and total protein in bronchoalveolar lavage fluid were significantly decreased(P ＜0.01)in the UTI-pretreatment group，and the expression of CC16 mRNA and protein increased significantly.Conclusions CC16 plays an important role in ventilator-induced lung injury(VILI).The expression of CC16 mRNA and protein are reduced in a VILI rat model.Ulinastatin may effectively prevent the inflammatory process and ventilator-induced lung injury by increasing the level of CC16 and inhibit the lipid peroxidation.

Mechanical ventilation;Acute lung injury;CC16;Ulinastatin;Rat

R33

A

1671-7856(2011)04-0024-04

2010-11-12

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.004.006

山西省科技攻關項目，2007032016-1;太原市科技項目計劃任務書，0801041)。

王曉艷(1985-)，女，碩士，主要研究方向：機械通氣與肺損傷。Email：wxiaoxiao85@163.com。

張新日，碩士生導師，Email：ykdzxr61@yahoo.com.cn。