結核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表達載體的構建

袁 偉，劉江寧，向志光，林樹柱，張麗芳，秦 川

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021)

結核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表達載體的構建

袁 偉，劉江寧，向志光，林樹柱，張麗芳，秦 川

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021)

目的 構建結核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因，并對其在體外真核細胞中進行表達。方法用PCR法從結核分枝桿菌H37Rv株基因組中分別擴增 Ag85B、Esat6、HspX基因，插入到 pUC19-T載體，序列測定正確后，將融合基因再次克隆到真核表達載體pcDNA3.1(-)。重組質粒經酶切鑒定并測序正確后，用MegaTran 1.0轉染293T細胞，并用Western-Blot檢測目的蛋白的表達。結果 Western-blot檢測到分子量大小約65 kDa的目的蛋白。結論 成功地構建了結核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表達載體，且該重組載體可在體外真核細胞中獲得特異性的表達。

結核分枝桿菌;Ag85B;Esat6;HspX

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病。據世界衛生組織報道，目前全球有近1/3的人感染了結核桿菌。隨著多重耐藥菌、極度耐藥株的出現，艾滋病與結核共感染人群的增加使得活動性結核病人日益增多［1］。卡介苗(BCG)是法國科學家Camille Guerin和Charles Calmette在上個世紀第一個10年中開發出來的，1921年開始應用于人類，迄今已使用了80多年。在世界衛生組織免疫接種擴大方案中，卡介苗作為目前唯一的結核病疫苗正在廣泛使用。接種后可預防兒童發生結核病，但卡介苗對成人肺結核的保護效率差別很大(0-80%)。抗原85復合體是一組具有較強細胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白。該復合體由 Ag85a、Ag85b、Ag85c構成。抗原分析表明 3者中以 Ag85a和 Ag85b最具有免疫原性。EAST6(6kD early secretory antigenic target)即6KD早期分泌性抗原性蛋白，是從結核桿菌短期培養濾液中純化分離出的一種低分子量的分泌性蛋白，具有較強的細胞免疫活性。HspX為結核菌休眠期調控子(DosR Regulon)中的基因 hspx(Rv2301)編碼的16kD蛋白，屬于小分子熱休克蛋白家族。有研究表明HspX在結核分枝桿菌感染后短時間內減緩其在體內生長速度方面可能起到某種關鍵作用［2］。休眠狀態結核桿菌在人體內是普遍存在的。感染機體的結核桿菌可能有處于休眠狀態的。結核桿菌被巨噬細胞吞噬后，受到天然免疫物質NO等的攻擊，可能轉入休眠狀態。同時，處在結核結節低氧環境中的細菌，也大多轉入休眠狀態。卡介苗(BCG)免疫機體后，由于休眠期抗原表達量低，不能針對休眠期細菌產生免疫反應，導致對休眠狀態結核桿菌沒有免疫保護。然而在與結核病患者密切接觸的健康人群中，發現對休眠期抗原存在很強的免疫應答［3］。由于HspX是結核分枝桿菌潛伏感染期機體免疫反應的重要靶抗原，所以含有該抗原或抗原基因的疫苗可能會增強潛伏感染人群體內的細胞免疫，進而清除結核菌。本研究構建了Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表達載體，為下一步結核新型疫苗的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒和細胞系

E.coli DH5a感受態細胞購自北京全式金生物技術公司。MTB H37Rv株由中國生物制品檢定所惠贈。pUC19-T載體、真核表達載體 pcDNA3.1(-)由本室保存。293T細胞系凍存于本室。

1.2 試劑

Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamH I、Hind III及DNA分子量marker均購自Takara大連公司。質粒小量抽提試劑盒購于Promega公司。膠回收試劑盒購自Qiagen公司。脂質體MegaTran 1.0購自OriGene Technologies公司。胎牛血清及DMEM培養基為美國Gibco公司產品。Ag85B、Esat6抗體為美國Abcam公司產品，HspX抗體購自美國Santa Cruz公司。HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體及羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 MTB基因組DNA提取

將生長3～4周L-J培養的結核桿菌刮下，90℃水浴15 min滅活細菌。4 000 r/min離心10 min。棄上清液，1×TE溶液重懸細菌。加入溶菌酶37℃振蕩2 h，再加入蛋白酶 K，37℃振蕩過夜。加入等體積Tris飽和酚，8 000 r/min離心10 min。取上清液，加入等體積酚：氯仿：異戊醇，再次離心后，無水乙醇沉淀，溶于100 μL TE中。

1.4 融合基因的擴增及序列測定

根據已公布的 Ag85B、Esat6和 HspX基因的序列，設計引物，引物序列見表1。PCR反應體系為：

10 × buffer 2 μL，dNTP 2 μL，DNA 模板 1 μL，P1、P2 引物各 1 μL，高保真酶 0.2 μL，加水至 20 μL。PCR 反應條件：95℃ 變性 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 3 min，共 30 個循環，再 72℃延伸 5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，回收DNA條帶，按說明用凝膠DNA純化試劑盒純化擴增產物。取純化的 PCR產物與 pUC19-T載體，在T4 DNA連接酶催化下，于室溫連接2 h，轉化至E.coli DH5a感受態細胞，涂布于LB平板(含氨芐青霉素100 mg/L)。用菌落PCR法挑選陽性克隆，接種于5 mL含氨芐青霉素的 LB中，37℃振蕩培養過夜，小量提取質粒DNA，經酶切鑒定后，進行序列測定，由Invitrogen公司完成。

1.5 重組質粒的構建及鑒定

用BamH I和 Hind III雙酶切 pUC19-Ag85BEsat6-HspX質粒，獲得 Ag85B-Esat6-HspX融合基因，凝膠回收目的基因片段后再次克隆至同樣雙酶切的真核表達載體 pcDNA3.1(-)，轉化至 DH5a感受態細胞。用菌落PCR法挑選陽性克隆，接種于5 mL含100 mg/L氨芐青霉素的LB培養液，37℃振蕩培養過夜。提取質粒 DNA，用 BamHI和 HindIII雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒，并再次送Invitrogen公司進行序列測定。

表1 H37Rv基因組中擴增目的基因所需引物Tab.1 Primers for amplification of the genes from M.tuberculosis H37Rv

圖1 PCR擴增融合基因Fig.1 Amplification of fusion gene by PCR

圖2 雙酶切鑒定重組質粒Fig.2 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

1.6 細胞轉染

將2×105個/孔細胞接種于6孔板，細胞數量達孔底60%～70%時進行轉染。轉染前用不含抗生素的DMEM培養液洗2次。取1 μg/μL的重組質粒6 μL和2 μL MegaTran 1.0脂質體混勻后緩慢加入到細胞中，繼續培養48 h后收集細胞進行Western blot檢測。同時設不加任何處理的293T細胞作陰性對照。

1.7 Western blot檢測融合基因的表達

收集轉染后細胞，PBS洗滌后，加入裂解緩沖液充分裂解，離心后收集上清液，行免疫印跡分析。

一抗分別為抗Ag85B的多克隆抗體、抗 Esat6的單克隆抗體和抗HspX的單克隆抗體。二抗為HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體及羊抗兔IgG抗體(稀釋比例為 1∶10 000)。

2 結果

2.1 融合基因的擴增

以MTB H37Rv基因組為模版，用合成的融合基因引物PCR擴增，經30個循環，可擴增出與預計長度相等的1 800 bp左右片段(圖1)。將目的基因片段回收后再克隆入 pUC19-T載體，酶切鑒定后測序。測序結果證明所擴增的融合基因序列完全正確(資料未顯示)。

2.2 重組質粒的構建及鑒定

將測序正確的pUC19-Ag85B-Esat6-HspX質粒經雙酶切后與同樣處理的 pcDNA3.1(-)連接轉化，菌落PCR挑選陽性克隆，用BamHI和HindIII雙酶切后，可切出約1800 bp的片段(圖2)，再次測序結果證明克隆正確。陽性克隆命名為pcDNAAg85B-Esat6-HspX。

2.3 Western blot檢測融合蛋白表達

分別用抗Ag85B抗體、抗Esat6抗體和抗HspX的抗體與SDS-PAGE凝膠電泳后轉移的PVDF膜雜交。結果顯示：每個抗體均能檢測到大小為65 kDa的蛋白，與預期的蛋白大小一致。證明重組質粒能夠在真核細胞中穩定表達(圖3)。

圖3 Western blot檢測融合蛋白的表達WT： wild type group，Mo： empty vector group，FU：Fusion protein groupFig.3 The expression of fusion protein by determined by Western blot

3 討論

DNA疫苗是20世紀90年代發展起來的一種新型疫苗。自1996年WHO將結核病DNA疫苗研究列為資助項目以來，其發展十分迅速。該疫苗有如下特點：①細胞內生成的抗原易于被MHCI類和II類分子呈遞，可激活細胞毒性T淋巴細胞和輔助T淋巴細胞;②在一段時間里持續表達抗原，具有較強的免疫刺激作用;③操作技術簡單。結核DNA疫苗能夠很好地激發細胞免疫反應，是理想的結核疫苗形式。一些結核保護性抗原的DNA疫苗如Mtb8.4，Ag85B，ESAT6，Hsp65 和 MPT83 等都能誘導小鼠細胞介導的免疫反應。

范雄林等［4］在小鼠模型上將不同結核保護性抗原的DNA疫苗進行了免疫原性及保護效力的比較，發現Ag85B是比較理想的候選抗原。王清民等［5］對融合泛素的 Esat6核酸疫苗進行了研究，發現該DNA疫苗不僅增強了細胞免疫反應，而且對結核感染提供了很好保護。此外，細胞因子不僅可作為免疫佐劑增強DNA疫苗的免疫原性還可以誘導DNA疫苗刺激機體后所產生免疫應答的方向。將細胞因子和抗原嵌合表達或共同導入體內表達被證實有增強結核疫苗保護力的作用。師長宏等［6］構建的人 IL-2與 Hsp65融合基因的 DNA疫苗，對感染結核的小鼠有很好的預防保護效果。

結核病疫苗目標人群大體分為三類：正常人群(未感染結核分枝桿菌)、潛伏感染人群(已感染結核桿菌但未發病)、免疫低下人群(由于各種原因免疫功能低下)。隨著人們對潛伏感染的認識，休眠期結核桿菌開始受到重視。休眠期結核桿菌為了適應缺氧等惡劣生存環境部分基因表達上調。Leyten EM等［7］用 25種 DosR Regulon編碼的休眠期抗原進行實驗，發現與結核病人相比，健康的結核菌素實驗陽性者外周血單個核細胞(PBMC)能識別更多的休眠期抗原，并產生更強烈的IFN-γ反應。HspX抗原可以被致敏的T細胞識別，刺激T細胞分泌IFN-γ，具有細胞免疫和體液免疫原性。在健康的與肺結核患者密切接觸的家人(80%)和醫務工作者(90%)中，HspX具有明顯的T細胞刺激活性，比例明顯高于普通人群(50%)，提示HspX抗原具有免疫保護作用。

本研究將休眠期抗原與對數生長期抗原聯合使用，成功構建了能夠在真核細胞表達融合蛋白的重組質粒，為進一步研究該融合蛋白的免疫原性及保護作用奠定了基礎。

［1］ Gandhi NR，Shah NS，Andrews JR，et al.HIV coinfection in multidrug-and extensively drug-resistant tuberculosis results in high early mortality［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，181：80-86.

［2］ Hu Y，Movahcdzadeh F，Stoker NG，et al.Deletion of the Mycobacterium tuberculosis alpha-crystallin-like HspX gene causes increased bacterial growth in vivo［J］.Infec Immun，2006，74(2)：861-868.

［3］ Vekemans J，Ota MO，Sillah J，et a1.Immune responses to mycobacterial antigens in the Gambian population：implications for vaccines and immunodiagnostic test design［J］.Infect Immun，2004，72(1)：381-388.

［4］ Fan XG，GaoQ，FuRL.Differentialimmunogenicityand protective efficacy ofDNA vaccines expressing proteins of Mycobacterium tuberculosis in a mouse model［J］.Microbiol Res，2009，164：374-382.

［5］ Wang QM，Kang L，Wang XH.Improved cellular response elicited by a ubiquitin-fused Esat6 DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis［J］.Microbiol Immunol，2009，53：384-390.

［6］ Shi CH，Zhang H，Wang LM，et al.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 of Mycobacterium tuberculosis and the human interleukin2 fusion gene［J］.Tuberculosis，2009，89： 54-61.

［7］ Leyten EM.Human T-cellresponsesto25 novelantigens encoded by genes of the dormancy regulon of Mycobacterium tuberculosis［J］.Micorbes Infect，2006，8：2052-2060.

Construction of an Eukaryotic Expression Vector Encoding the Ag85B-Esat6-HspX Fusion Protein against Mycobacterium Tuberculosis

YUAN Wei，LIU Jiang-ning，XIANG Zhi-guang，ZHANG Li-fang，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

Objective To construct fused gene Ag85B-Esat6-HspX of Mycobacterium tuberculosis and investigate its expression in eukaryotic cells in vitro.Methods The gene encoding Ag85B，ESAT6 and HspX protein was amplified by PCR from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain，and was inserted into cloning vector pUC19-T.After the sequence was confirmed，the fused gene was subcloned to eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-).After identified by restriction enzymec digestion and verified by DNA sequencing again，the recombinant plasmid pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX was transfected into 293T cells with MegaTran 1.0.Western blot was used to detect the expression of goal protein.Result A 65 kDa protein was detected with specific antibodies.Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNAAg85B-Esat6-HspX has been constructed successfully and the fusion protein could be expressed specifically in 293T cells.

Mycobacterium tuberculosis;Ag85B;Esat6;HspX

R521;R33

A

1671-7856(2011)04-0052-04

2010-09-28

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.04.012

十一五重大專項支持(2009ZX1004-402)。

袁偉(1977-)，博士研究生。Email：docyw@sohu.com。

秦川，教授，博士生導師。Email：chuanqin@vip.sina.com。