乳品中大腸菌群快速檢測片的研究

段學輝，魏斌，傅奇，郭炳其，賈奎艷

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌330047）

乳品中大腸菌群快速檢測片的研究

段學輝，魏斌，傅奇，郭炳其，賈奎艷

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌330047）

建立了乳品中大腸菌群檢測片快速檢測方法，即以國標法中的乳糖發酵管培養基為基本營養成分，優化添加輔助營養成分、指示劑、緩沖劑、選擇性抑菌劑，通過冷水凝膠劑等均勻固化于基片上，樣品滴加檢測片上，培養16～18 h即可直接依據檢測片顏色的變化定量檢樣中大腸菌群的含量，結果可用MPN值報告。實驗以多管發酵法為對照，分別用標定菌濃的大腸桿菌菌液和市售乳品樣進行對比檢測，結果表明，檢測片的最低檢出限為0～4 mL-1，所測結果與國標法結果相比符合率為96.7%，樣品檢測報告時間縮短50多小時，兩種方法所測結果在統計學上無顯著性差異(P＞0.05)，快速檢測片作為一種價廉、簡單、快捷、準確的檢測方法，能應用于乳品中大腸菌群的快速檢測。

乳品；大腸菌群；快速檢測片

0 引言

大腸菌群在食品安全中受到嚴格監控，是評價食品衛生質量的重要指標之一，大腸菌群的檢測日益受到食品生產企業和衛生監測部門的高度關注。乳品中大腸菌群的檢測通常采用國標多管乳糖膽鹽發酵法，但乳品中的基質容易對結果造成干擾[1]，且檢測耗時費力，報告一個陽性結果需要72 h，難以滿足實際生產和監測中的快速檢測需要。隨著食品衛生檢測技術的發展，酶分析法[2]、分子生物學法[3-5]和儀器分析法[6-8]等技術方法逐漸得到應用，但新方法對儀器設備和操作人員有特殊要求，生產企業和基層衛生監測部門的設備和操作水平難以適用。本文報道了一種大腸菌群快速檢測片研制及其應用效果，為生產企業和監測部門提供了一種乳品中大腸菌群的快速檢測方法。

1 實驗

1.1 材料

菌種為大腸桿菌；鮮奶；酸乳；奶粉（市售）。

氯化三苯四氮唑（TTC）、氯化鈉、磷酸氫二鉀等均為分析純，膽鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴甲酚紫、PEG、黃原膠、瓜爾豆膠、卡拉膠、聚丙烯酸鈉、層析硅膠等均為化學純，中速定性濾紙(規格為5cm×5 cm，11cm×11 cm)，聚乙烯樹脂薄膜

1.2 培養基

營養瓊脂：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，pH值為7.3±0.1，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌15 min。

乳糖膽鹽發酵培養基[9]：蛋白胨20 g，乳糖10 g，膽鹽5 g，氯化鈉5 g，質量分數為0.04%溴甲酚紫溶液2.5 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4，115℃滅菌15 min。

改良浸液配方：胰蛋白胨10 g，乳糖15 g，SDS 0.1 g，質量分數為2%的TTC溶液5 mL，磷酸氫二鉀4 g，氯化鈉3 g，質量濃度為1.6 g/100mL溴甲酚紫溶液4 mL，蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌15 min。

1.3 菌懸液制備

劃線甘油管中保藏的大腸桿菌于斜面培養基上，在37℃條件下培養24 h，用無菌生理鹽水制成菌懸液。

檢測流程如圖1所示。

1.4 吸水率的測定[10]

分別稱取0.1g干燥凝膠劑樣品，放入300 mL燒杯中，加入100 mL去離子水，室溫下溶脹1.5 h后，以100目濾網過濾15 min，記下濾液量，分別計算各凝膠劑在去離子水中的吸收量，吸水率為

式中：V初始為凝膠劑吸水前加入去離子水體積；V濾出水為凝膠劑吸水后濾出溶液體積；M凝膠劑質量為加入凝膠劑的質量；ρ為水的密度1.0 g/mL。

1.5 凝膠劑的保水性能分析

稱取0.1 g各凝膠劑粉末于300 mL燒杯中，加入100 g去離子水，配制成質量濃度為0.1 g/100 mL的凝膠劑溶液。將直徑為7 cm的中速濾紙浸漬于各凝膠溶液中1 min，待干燥后，分別放于各平皿內，稱重(m1)。向各皿內的濾紙片上分別滴加1 g去離子水，平皿上覆蓋一層保鮮膜，放入37℃恒溫培養箱中，每隔4 h測定一次(m2)。以保水百分率對時間作圖，保水率為

2 結果與討論

2.1 不同凝膠劑對吸水率和保水性性能的影響

實驗選取常用凝膠劑瓊脂、PEG、黃原膠、瓜爾豆膠、卡拉膠、聚丙烯酸鈉、層析硅膠。通過吸水率和保水性實驗來考察凝膠劑的性能，實驗結果如圖2和圖3所示。

由圖2可以看出，聚丙烯酸鈉的吸水量達到388.00g/g，黃原膠為40.70 g/g，瓜爾豆膠為39.60 g/g，而PEG、卡拉膠、瓊脂、層析硅膠的吸水量僅分別為12.25，16.30，17.05，19.85 g/g。聚丙烯酸鈉的吸水量是常用凝膠劑瓊脂的20多倍，能比瓊脂吸附更多的檢測片浸液溶質，在檢測時又能輔助檢測片吸附檢樣。

圖2 各凝膠劑吸水量對比

由圖3可以看出，含有0.1 g不同凝膠劑的浸漬檢測片放置于37℃恒溫培養箱中，放置16 h后，含聚丙烯酸鈉的保水率為52.71%，空白組為25.25%，24 h后，含聚丙烯酸鈉的保水率為23.65%，而空白組的保水率已降至0。聚丙烯酸鈉對檢測片的保水效果最好，檢測常用的凝膠劑瓊脂在短時間內對檢測片有一定的保水作用，至16 h時為39.40%，24 h后水分基本蒸發完全。相對于空白組，PEG、黃原膠、卡拉膠、聚丙烯酸鈉、層析硅膠等使檢測片的保水率均有不同程度的提高。結合各凝膠劑對檢測片的吸水量和保水率的影響，聚丙烯酸鈉具有相對優勢，替代瓊脂為本研制檢測片所用凝膠劑。

圖3 各凝膠劑對檢測片保水性能的影響

2.2 緩沖劑濃度對培養基pH值和檢測片顯色靈敏度的影響

緩沖劑磷酸氫二鉀具有調節培養基pH值和緩沖檢樣pH值變化的雙重作用。實驗選取磷酸氫二鉀作為緩沖劑，配制兩組系列質量濃度，一組為0～1.0 g/100 mL系列質量濃度；另一組為1.0～2.5 g/100 mL系列質量濃度。115℃滅菌15 min，加入已滅菌的TTC，浸漬紙片，待干燥后，分別滴加1 mL含10～102mL-1大腸桿菌的模擬鮮乳樣和酸乳于檢測片上，觀察對檢樣的緩沖效果，同時測定磷酸氫二鉀各濃度下的浸漬液pH值，實驗結果如圖4和圖5所示。

由圖4中看出，當緩沖劑質量濃度小于0.4 g/100mL時，隨著磷酸氫二鉀質量濃度的增加，檢測片檢出的菌落數有明顯增加，質量濃度達到0.4 g/100 mL時，檢出的菌落數最多，此時pH值為7.112，繼續增加緩沖劑濃度，檢測片上可觀察的黃斑菌落數略有減少。由于溴甲酚紫的變色pH值范圍為5.2～6.8，而含有質量濃度為0.2 g/100 mL磷酸氫二鉀的培養基滅菌后pH值為6.693，仍處在溴甲酚紫的變色范圍內，故檢測片的顯色效果欠佳。當緩沖劑質量濃度為0.4 g/100 mL時，pH值接近指示劑的變色pH臨界值，且檢測片顯色效果良好，此時檢測片的靈敏度相對較高，雖然添加高于此質量濃度的緩沖劑，檢測片的顯色效果良好，但不利于產酸能力弱的大腸菌群的檢出，降低了檢測片的靈敏度。

圖4 不同質量濃度磷酸氫二鉀對靈敏度的影響

乳品中的酸奶成弱酸性，檢測片在檢測酸奶樣品時，緩沖劑需要發揮對檢樣的緩沖作用。由圖5可看出，緩沖劑各質量濃度下檢測片呈現的緩沖效果。在質量濃度為1.0 g/100 mL和1.5 g/100 mL時，緩沖劑的緩沖作用失效，檢測片滴加酸奶檢樣立即變黃；2.0g/100 mL時檢測片局部微黃，經幾分鐘緩沖作用后檢測片又為藍紫色。當緩沖劑質量濃度為2.5 g/100 mL時，緩沖效果明顯，加樣前后檢測片均呈藍紫色，且培養后的菌斑清晰可見。圖5中，（a）的pH值為7.342；（b）的pH值為7.365；（c）的pH值為7.412；（d）的pH值為7.447。

圖5 磷酸氫二鉀用量對酸奶檢樣的緩沖效果

2.3 TTC 濃度對顯色效果的影響

分別加滅菌后質量濃度為2 g/100 mL的TTC 0.05，0.1，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40 mL于50 mL改良浸液培養基中，混勻后浸泡紙片，干燥后接種大腸桿菌稀釋液，37℃培養16 h后觀察菌落顯色效果，結果如表1所示。

由表1可以看出，當浸漬液中加入0.05 mLTTC時，大腸桿菌在檢測片上生長，菌落幾乎不著色；TTC加入量為0.1 mL和0.15 mL時，檢測片上的菌落成微紅色；0.20 mL時部分菌落顯色清晰，部分微紅色；而0.25～0.40 mL時，菌落均顯紅色，易于觀察計數，但隨著TTC用量的提高，大腸桿菌的生長略微受到抑制，因此TTC用量以0.25 mL為宜。

表1 不同質量分數TTC的顯色效果

2.4 檢測片基質組成優化

檢測片基質在加入質量濃度為1.6 g/100mL溴甲酚紫0.2 mL的情況下，通過單因素試驗選取胰蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、SDS、TTC、氯化鈉、聚丙烯酸鈉等7個因素，分別取3個水平，采用L18（37）正交實驗，實驗設計如表2所示，每組3個平行實驗。

表2 浸液配方的因素水平

實驗結果采用直觀分析法，18次實驗的菌落計數結果如表3所示。由表3可以看出，浸液配方中主要成分對于大腸菌群測定的影響順序為：SDS＞胰蛋白胨＞磷酸氫二鉀=TTC＞聚丙烯酸鈉＞氯化鈉＞乳糖，正交實驗的優化組合為A1B1C2D1E2F1G1或A1B1C2D1E2F1G2。實驗數據的方差分析結果如表4所示。由表4可以看出，抑菌劑SDS（D）對實驗的影響顯著，因此，抑菌劑用量應該嚴格按控量添加，這對于檢測片大腸菌群正常生長和有效抑制非大腸菌群的干擾非常重要。

2.5 檢測片性能與常規方法的比較

選擇精確定濃的大腸桿菌菌懸液，采用本研究檢測片與食品中總大腸菌群檢測方法中的多管發酵檢測法、平板法進行檢測性能比較，考察它們的檢出限、重復性、報告時間、檢測步驟繁簡性、檢測成本等關鍵性能指標，實驗比較結果如表5所示。

由表5中可以看出，檢測片的檢出限、重復性、報告時間、檢測步驟繁簡性、檢測成本等關鍵性能指標優于目前常用的多管發酵檢測法和平板檢測法。

2.6 快速檢測片的商品檢測應用效果

實驗在市場中隨機取樣鮮乳、酸乳、奶粉各20份，分別用研制的快速檢測片和國標法進行大腸菌群含量檢測，分析結果如表6所示。

由表6可以看出，快速檢測片法與國標法對樣品中大腸菌群的檢測報告結果總符合率為96.7%，其中檢測片法和國標法各檢出2份陽性樣品。對兩種方法檢出的陽性與陰性樣品數進行χ2檢驗分析，快速檢測片法和國標法在統計學上無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 正交實驗結果

表4 方差分析

3 結束語

（1）凝膠劑一直作為微生物培養基載體被廣泛應用。聚丙烯酸鈉對微生物無毒害作用[11]，常溫下可溶于水，具有超強的吸水能力和良好的保水性能。能有效地吸附檢樣，保障菌群生長環境中必須的水分。檢測片浸漬液凝膠劑常溫下不易凝固，簡化了浸液維持溫度條件的操作，解決了不加瓊脂的浸液不能穩定均勻地固定于基片的缺點。

表5 3種方法檢驗的關鍵指標比較

表6 檢測片法和國標法檢測乳品中大腸菌群結果比較

（2）磷酸氫二鉀緩沖劑在配制培養基時具有調節pH值的作用，在接種檢樣時，具有對檢樣酸環境變化的緩沖作用。使檢測片接種酸性檢樣時指示劑依然能夠有效顯示。檢測片用于鮮乳或奶粉樣品檢測時，培養基加入質量濃度為0.4 g/100 mL磷酸氫二鉀為宜；檢測酸奶時，加入質量濃度為2.0 g/100 mL磷酸氫二鉀可達到對檢樣的緩沖和提高檢測靈敏度。

（3）TTC是一種氫受體，在大腸菌群生長過程中產生的琥珀酸脫氫酶作用下，TTC將氫（H）還原成紅色不溶性的甲賛，使菌落著色成紅色。因此TTC的添加可避免乳品檢樣基質特性對檢測的干擾。大腸菌群檢測片培養基中每50 mL加入質量濃度為2 g/100 mL的TTC溶液0.25 mL，檢測菌落顯色效果較好。當TTC用量過少時，檢測片上菌落著色淺或無，用量過多時又會對大腸菌群的生長產生抑制作用。

（4）本檢測片法結果的報告形式，適用現行食品標準中規定的食品微生物學大腸菌群的測定和大腸菌群的計數，能以多片檢測片代替國標中的多管發酵，具有與國標法相同的靈敏性，且操作簡單，準確性高，檢測時間只需16～18 h，比國標法的72 h縮短了54 h，檢測效率得到明顯提高。

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Rapid detection of coliforms in dairy using test strip

DUAN Xue-hui，WEI Bin，FU Qi，GUO Bing-qi，JIA Kui-yan
(State Key Laboratory of Food Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

In this study,a rapid and simple method for detection the total coliforms in dairy,fixing optimal nutrient including basic nutrition and supplementary nutrition,indicating agent,buffering agent,specific bacteriostatic agent on the designed strip through cold gel was investigated.Based on strip color change,coliforms can be quantitatively reported as MPN,and the overall assay time only needed of 16-18 hours.The conditions of the detection such as the species of cold gel and proportion of medium,as well as the concentration of indicating agent and buffering agent were studied.This method was compared to the multiple-tube fermentation using calibration of standard strain for the analysis of samples,the rapid test strip showed low detection limit of 0-4 cfu/mL.A high agreement(96.7%)was found between rapid test strip and standard on 60 commercial dairy samples.No significant difference(p＞0.05)was found between the detection results for the methods.The test strip method was cost-effective,simple,rapid and accurate,can be used to detect coliforms in dairy.

dariy;coliform bacreria;rapid test strip

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0038-04

2010-10-12

段學輝(1958-)，男，教授，從事食品生物技術方向研究。