響應曲面法優化鼠李糖乳桿菌L7-13增菌因子

胡博，梁金鐘

（哈爾濱商業大學食品工程學院，哈爾濱150076）

響應曲面法優化鼠李糖乳桿菌L7-13增菌因子

胡博，梁金鐘

（哈爾濱商業大學食品工程學院，哈爾濱150076）

采用響應面方法對鼠李糖乳桿菌L7-13的增菌因子進行了優化。以MRS培養基作為基礎培養基，在此基礎上添加增菌因子；采用單因素實驗設計法，對幾種乳酸菌生長促進因子對鼠李糖乳桿菌L7-13的增菌影響進行評價；篩選出對鼠李糖乳桿菌L7-13增菌效果顯著的3種物質以其最佳添加量；然后用旋轉中心組合設計及響應面分析法確定了3種顯著增菌因子的最佳配比。在優化后的培養基中，鼠李糖乳桿菌L7-13的菌體濃度達到8.1×1010mL-1，比優化前的活菌數7.9×108mL-1提高了近百倍。表明此增殖優化培養基適于鼠李糖乳桿菌L7-13菌株的生長繁殖。

鼠李糖乳桿菌；響應曲面；增菌因子

0 引言

益生菌鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，簡稱LGG)從健康人的腸道中分離得到[1-3]，因其具有的益生特性和自身特點而被深入研究和廣泛應用[5]。

隨著益生菌研究不斷深入，也出現了一些問題，比如市售的益生菌產品不但所用的菌種不同，而且在活菌含量、產品中的穩定性、耐酸性、耐膽汁性及有無腸溶性等方面的差別，也會明顯影響有效性[6]。

響應面法(Response surface methodology,RSM)是一種優化過程的綜合技術,它可快速有效地確定多因子系統的最佳條件,該法己經廣泛地應用于各類培養基以及發酵條件的優化實踐中[10，11]。

因此，本實驗基于以上因素，選取鼠李糖乳桿菌L7-13菌株，在MRS培養基的基礎上，利用Design Expert軟件(Version 6.0)響應面設計法，對培養基的增菌因子進行優化，最終達到增菌的目的。

1 實驗

1.1 材料與設備

菌種為鼠李糖乳桿菌L7-13(Lactobacillus rhamnosus GG L7-13)株。

牛肉粉，蛋白胨，酵母粉，瓊脂粉，無水乙酸鈉，葡萄糖，磷酸氫二鉀（生化試劑），蜂蜜（市售），豆漿，紅棗汁（自制），低聚果糖，乳清粉，酪蛋白水解物（食品添加劑）。

1.2 儀器設備

721型分光光度計，LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺，DHG-9203型電熱恒溫鼓風干燥箱，PHS-3C型pH計，DHP-9162型電熱恒溫培養箱。

1.3 培養基

活化和計數培養基（MRS基礎培養基）：蛋白胨1.00 g，牛肉粉1.00 g，酵母粉0.50 g，葡萄糖2.00 g，吐溫80 1.00 mL，乙酸鈉0.50 g，檸檬酸二銨0.20 g，MgSO4·7H2O 0.058 g，MnSO4·4H2O 0.025 g，K2HPO40.20 g，蒸餾水100 mL，pH值為6.2～6.4，121℃滅菌15 min后備用。

1.4 方法

1.4.1 菌種的活化與傳代培養

將斜面保藏菌種接種于MRS固體培養基中，37℃恒溫培養48 h，得到純菌種后，按質量分數2%的接種量傳代培養于MRS液體培養基中，37℃恒溫培養48 h，作為種子液備用[7-9]。

1.4.2 顯著增菌因子的篩選

采用單因素實驗，以MRS培養基作為基礎培養基，選取添加一定量的豆漿、紅棗汁、乳清粉、蜂蜜、酪蛋白水解物、低聚果糖等可能促進乳酸菌的生長的增菌因子作為考察對象，37℃恒溫培養48 h，分別測其活菌數，以MRS培養基+0(g)mL/100 mL各生長因子為空白對比實驗，對數據進行單因素方差分析，從而篩選出顯著增菌因子。

其中各組分的質量濃度分別為：豆漿、紅棗汁5.0～15.0 mL/100 mL，乳清粉0.5～4.0 g/100m L，蜂蜜1.0～4.0 g/100 mL，酪蛋白水解物的添加量0.3～4.0 g/100 mL、低聚果糖0.5～3 g/100 mL。

1.4.3 優化混合增菌因子的配比

篩選出影響鼠李糖乳桿菌L7-13株的幾種顯著增菌因子后，采用旋轉中心組合設計(Central Composite Rotatable Design，CCRD)法，對其混合增菌因子進行進一步優化配比，以獲得該菌體的混合增菌因子的配方。

中心組合設計的總實驗總數為2K+2K+n0，其中K為自變量總數，n0為中心點實驗數。自變量Xi按下式進行編碼變換：

式中：Xi為自變量Xi的編碼值，X0為自變量Xi在中心點的值，△xi為自變量變化步長。

用標準多項式回歸方法，對實驗數據進行擬合，便得到一個二次多項式，該方程為描述響應量(應變量)和自變量關系的經驗模型。對于2因子系統，模型可描述為：

式中：Y為預測響應值；β0為截距；βi為線性系數；βij為平方系數；βij為交互作用系數。

本階段實驗輔助軟件為Design Expert軟件(Version 6.0)。實際考察的變量及其實驗水平編碼如表1所示；采用多元回歸技術，擬合二次多項模型的CCRD設計結果如表2所示。

1.4.4 活菌數測定

采用稀釋平板計數法，將菌液10倍遞增稀釋到合適濃度后，取3個適當稀釋度，各抽取0.1 mL菌液于滅好菌的培養皿中，倒入融化好的MRS固體培養基，混合均勻，每個稀釋度做3個重復實驗，待凝固后，放入恒溫箱，37℃培養48 h，計菌落數（菌落數在30～300個內有效）[9]。

活菌數=稀釋度×平均活菌數/個平皿×0.1 mL。

2 結果與分析

2.1 顯著增菌因子的篩選及其最佳濃度的確定

MRS培養基的基礎上分別添加一定量的豆漿、紅棗汁、乳清粉、蜂蜜、酪蛋白水解物、低聚果糖，按質量分數為2%的接種量接入100 mL三角瓶中，37℃恒溫培養48 h，測其活菌數，與不加增菌因子接種在MRS培養基的鼠李糖乳桿菌L7-13進行比較，并對所得數據進行分析。實驗數據直方圖如圖1-圖6所示。

圖1 紅棗汁的添加量對L7-13的影響

圖2 豆漿的添加量對L7-13的影響

圖3 酪蛋白水解物添加量對L7-13的影響

圖4 乳清粉添加量對L7-13的影響

圖5 低聚果糖添加量對L7-13的影響

圖6 蜂蜜添加量對L7-13的影響

進行單因素方差分析可知：豆漿(P=0.12068)、紅棗汁(P=0.115275)、乳清粉(P=0.000668)、蜂蜜(P=0.123862)、酪蛋白水解物(P=2.64×10-5)、低聚果糖(P=1.59×10-5)所以，乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖是影響鼠李糖乳桿菌L7-13增殖的顯著增菌因子。因此，選擇乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖作為L7-13的顯著生長因子，進一步考察它對L7-13生長的影響。其他可信度較小的因素對L7-13的增殖無明顯影響，在下一步的培養基優化中可不考慮。

2.2 響應曲面法(RSM)優化混合增菌因子的配比

2.2.1 L7-13菌體濃度多元二次模型方程的建立及檢驗

從以上單因素實驗可知，乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖是L7-13的顯著生長因子。因此以MRS培養基為基礎培養基，選擇以上3個因子為研究對象，以L7-13菌體濃度即活菌數為響應值，設計旋轉中心組合實驗如表1。根據實驗設計表進行了20組實驗，其結果如表2所示。

表1 旋轉中心組合設計實驗因素水平及其編碼g/100mL

X1=(x1-2)/0.5；X2=(x2-2)/0.5；X3=(x3-1)/0.5。

通過Design expert軟件對表2實驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得L7-13菌體濃度對乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖的二次多項式回歸方程為

表2 旋轉中心組合設計及其實驗結果

Y=80.66-5.60X1-5.44X2-2.71X3-17.19X12-15.42X22-15.17X32+0.050X1X2-0.30X1X3+0.33X2X3(3)

式中：Y為L7-13菌體濃度的預測值；X1，X2，X3分別為乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖的編碼值。由以上方程得出的L7-13菌體濃度預測值如表2所示。該二次回歸方程及其各項的方差分析結果如表3所示。

表3 L7-13菌體濃度二次多項模型及其各項的方差分析

由表3可以看出，該模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項在α=0.1水平上不顯著(P=0.0775＞0.05)，而且經分析計算，該模型的確定系數R2=0.9735，表明模型與實際情況擬合很好，因此該模型可用于預測L7-13的實際生長增殖情況。由表3回歸方程各項的方差分析表明，各因素對L7-13菌體濃度的線性效應皆顯著；且各因素對L7-13菌體濃度的曲面效應也顯著；X1X3，X2X3，X1X2的交互影響顯著。

2.2.2 L7-13菌體濃度響應面交互作用與優化

由方程(3)所作的響應曲面圖及其等高線圖如圖7～圖9所示。各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過該組圖直觀反映出來。

由圖7可以看出，在本研究水平范圍內，隨著培養基中乳清粉含量的增大，L7-13的菌體濃度增加，但其濃度超出一定量時，反而抑制了L7-13的增殖。即當乳清粉質量濃度處于1.64～2.21 g/100mL范圍內，當低聚果糖質量濃度在1.79～2.07 g/100mL范圍內時，才可獲得7.85×1010mL-1的較高的菌體濃度。

乳清粉中含有大量的乳糖和乳蛋白素,能夠為植物乳桿菌提供豐富的營養物質,可刺激乳酸菌的生長繁殖。因此,它們是乳酸菌的天然促生長因子。

圖8顯示了乳清粉與酪蛋白水解物對L7-13增殖的交互影響效應。由圖8可以看出，當酪蛋白水解物在0.70～1.19 g/100 mL范圍內時，當乳清粉在1.70～2.15 g/100 mL范圍內時，才可獲得7.76×1010mL-1的較高的菌體濃度。

由圖9可見，當乳清粉質量濃度為2.00 g/100mL，酪蛋白水解物范圍在1.17～0.83 g/100 mL內時，低聚果糖的質量濃度只需1.64～2.21 g/100 mL，就能達到L7-13菌體濃度的較大值7.47×1010mL-1，而繼續增加酪蛋白水解物和低聚果糖的質量濃度對L7-13增殖均無益。

由此可見，乳酸菌的酶系比較單純，不能合成多種氨基酸、維生素和生長因子。因此，為使這些菌正常生長和大量增殖，除供給碳水化合物外，還必須補充其所不能合成的各種營養物質。

通過對L7-13菌體濃度模型進行求導和解逆矩陣，可以得到模型的極值點，乳清粉的添加量為1.92 g/100 mL，低聚果1.91g/100 mL，酪蛋白水解物0.95 g/100 mL，此時模型預測的最大響應值為7.8×1010mL-1。為了證實預測結果，在上述優化條件下和原始的菌體生長條件下分別進行重復實驗，得出實際菌體濃度為8.1×1010mL-1，可見該模型能較好地預測L7-13的菌體生長情況。

3 結論

本研究通過單因素實驗設計從幾種常見乳酸菌促生長因子中篩選出對鼠李糖乳桿菌增菌效果顯著的物質及其最佳添加量，通過響應曲面實驗設計優化其混合增菌因子的配方：乳清粉的添加量為1.92 g/100 mL，低聚果糖1.91 g/100 mL，酪蛋白水解物0.95 g/100 mL培養28 h后，測其活菌數從優化前7.9×108mL-1提高到8.1×1010mL-1，提高了近百倍。表明此增殖優化培養基適于鼠李糖乳桿菌L7-13菌株的生長繁殖，為后續研究以及產業化提供了依據。

4 展望

培養基優化僅僅是益生菌鼠李糖乳桿菌L7-13株研究的一個方面，還有許多方面的問題有待我們繼續研究和探索，比如它的基因測序、耐受性、培養條件以及微膠囊化方面的問題都需要我們更加深入的探索。我國對于鼠李糖乳桿菌的研究和含鼠李糖乳桿菌產品的開發起步較晚，而且鮮有產品問世，還需廣大從事功能性保健食品開發和藥品研究的科研工作者共同努力。

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Studies on enriching factor of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain by response surface methodology

HU Bo,LIANG Jin-zhong
(Harbin University of Commerce,Harbin 150076，China)

Response surface methodology was used to optimize the MRS-based enriching factor of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.According to the determination of viable count,the enriching effects of several additives were evaluated by using the single-factor test.screen out the main affecting factors on the Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.Then the central composite design and response surface analysis were used to determine the optimal levels of the main factors.Cultived in the optimized medium,the cell numerous of Lactobacillus rhamnosus L7-13 Strain increased from 7.9×108cfu/mL to 8.1×1010cfu/mL.Experiments showed that this media and culture conditions were suitable for growth and reproduction of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.

Lactobacillus rhamnosus;Response surface methodology;Enriching factor

Q936

A

1001-2230（2011）01-0019-04

2010-09-20

胡博（1985-），女，碩士研究生，研究方向為微生物發酵。通訊作者：梁金鐘