人α-乳白蛋白在奶牛乳腺上皮細胞中的表達

張莉，李慶章，田雷，崔英俊，趙冰，呂英，高學(xué)軍，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

人α-乳白蛋白在奶牛乳腺上皮細胞中的表達

張莉，李慶章，田雷，崔英俊，趙冰，呂英，高學(xué)軍，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

將人α-乳白蛋白（α-LA）0.76 kb的cDNA序列連接到PSV載體SV40啟動子后，構(gòu)建真核表達載體hα-LA–psv。將構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細胞，人α-乳白蛋白的表達量約為0.85 g/L。結(jié)果表明，構(gòu)建的真核表達載體能夠在體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞中高效表達人α-乳白蛋白。

人α-LA；基因表達；奶牛乳腺上皮細胞

0 引言

牛乳和人乳在組成上是有差別的，人乳蛋白主要是乳清蛋白，約占總蛋白的70%，其他的為酪蛋白，而牛乳蛋白主要是酪蛋白，約占總蛋白的78.8%，乳清蛋白含量低，所以改良牛乳的蛋白組成和含量，使之更接近于人乳，會提高牛乳的營養(yǎng)價值[1]。α-乳白蛋白是一種主要的乳清蛋白，具有調(diào)節(jié)產(chǎn)乳的功能[2]，還有細胞溶解活性[3]、誘導(dǎo)細胞生長抑制和細胞凋亡[4]等多種功能。使用基因重組技術(shù)在細胞和轉(zhuǎn)基因動物中表達α-乳白蛋白的研究目前只是在小鼠、大鼠和豬體內(nèi)進行，在反芻動物中還未見報道。本研究是在奶牛乳腺上皮細胞中進行人α-乳白蛋白的表達研究，為以后制備轉(zhuǎn)基因牛乳腺反應(yīng)器，生產(chǎn)含人α-乳白蛋白的轉(zhuǎn)基因牛奶，進行前期基礎(chǔ)研究。

1 實驗

1.1 材料

hα-LA-cDNA-T菌株與初步培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞（來自本實驗室），菌株JM109，pGEM-T載體，pSV-Galactosidase Control載體，TfxTM-20真核轉(zhuǎn)染試劑，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，膠回收試劑盒，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，F(xiàn)12培養(yǎng)基，角蛋白18抗體，鼠抗人alpha lactalbumin單克隆抗體（IgM），辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgM二抗，ECL發(fā)光液。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建及鑒定

大量提取hα-LA-cDNA-T質(zhì)粒和pSV載體質(zhì)粒，將它們用PstI和AgeI 37℃水浴雙酶切3 h后，分別純化回收0.76 kb的人α-乳白蛋白和3.55 kb的pSV黏性末端片段。將兩個片段用T4 DNA連接酶22℃水浴連接4 h后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細菌，挑選陽性克隆，搖菌擴增后提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。將經(jīng)雙酶切鑒定的陽性重組子命名為hα-LA–psv，質(zhì)粒于-20℃保存?zhèn)溆茫⒂?70℃保存菌種。

1.2.2 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定

初步培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞，加入質(zhì)量分數(shù)為15%DF12完全培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。根據(jù)上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶消化敏感性不同，在混合生長的細胞培養(yǎng)物中，用質(zhì)量分數(shù)為0.25%胰蛋白酶37℃消化，待成纖維細胞細胞質(zhì)回縮，脫離瓶壁時，終止消化，將酶液傾出，換完全培養(yǎng)液，經(jīng)2～3次如此選擇傳代后，即可得到純化的牛乳腺上皮細胞。應(yīng)用免疫熒光細胞染色法，使用激光共聚焦顯微鏡對純化后的牛乳腺上皮細胞角蛋白18的表達進行檢測。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染

將純化的奶牛乳腺上皮細胞以2×104/cm2的濃度接種12孔培養(yǎng)板，待細胞80%連生時，按照TfxTM-20說明書上的方法將重組質(zhì)粒hα-LA-psv轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞。

1.2.4 人α-乳白蛋白的Western Blot檢測

將轉(zhuǎn)染72 h的細胞，小心傾去培養(yǎng)液，加入裂解液裂解15 min后，再加入等量的2×SDS上樣緩沖液備用。SDS-PAGE電泳后，切取11～17 ku之間的部分，20V轉(zhuǎn)膜17 min，5%的脫脂奶粉封閉1h，按1∶600比例加入一抗，室溫混勻后，4℃過夜；TBST洗膜3次（每次5 min），按1∶2000的比例加入二抗，37℃作用1 h，TBST洗膜3次（每次6 min），加入ECL發(fā)光液作用2～3 min，曝光1～3 min，顯影30～50 s，水洗后，定影。掃描儀掃描結(jié)果后，Image-Pro Plus 5.0分析蛋白區(qū)帶，估算蛋白表達量。同時切取34～43 ku之間部分做GAPDH內(nèi)參（36 ku），20 V轉(zhuǎn)膜50 min，檢測。

2 結(jié)果

2.1 真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

將提取的PSV質(zhì)粒用AgeI和PstI大量雙酶切，將切去質(zhì)粒SV40啟動子后的β-半乳糖苷酶基因全部片斷余下的3.55 kb的黏性末端片段膠回收純化。純化后的片段與hα-LA-cDNA-T質(zhì)粒用AgeI和PstI大量雙酶切純化后的0.76 kb的人α-乳白蛋白黏性末端片段進行連接，得到真核表達載體hα-LA–psv。雙酶切鑒定結(jié)果，分別對應(yīng)于hα-LA-cDNA和PSV（去β-半乳糖苷酶基因全部片斷）的大小，與預(yù)期結(jié)果一致，如圖1所示，證實hα-LA-cDNA序列與PSV載體成功重組。

圖1 重組子hα-LA-psv的雙酶切鑒定圖譜

2.2 奶牛乳腺上皮細胞的純化和鑒定

純化培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞（圖2（a）），用免疫熒光細胞染色法檢測角蛋白18的表達，使用激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果（圖2（b）），同時用本實驗室純化的成纖維細胞作陰性對照（圖2（c））。圖中紅色的為PI標記的細胞核，綠色的為FITC標記的角蛋白18，結(jié)果說明得到的細胞是乳腺上皮細胞。

圖2 奶牛乳腺上皮細胞的純化和鑒定

2.3 細胞轉(zhuǎn)染及表達產(chǎn)物的檢測

轉(zhuǎn)染72 h的牛乳腺上皮細胞裂解液，用Western Blot方法檢測到了人α-乳白蛋白表達，掃描儀掃描結(jié)果后（圖3），用Image-Pro Plus 5.0分析蛋白區(qū)帶，估算得轉(zhuǎn)染72 h的細胞中人α-乳白蛋白的表達量約為0.85 g/L。

圖3 轉(zhuǎn)染72 h人α-LA基因表達檢測

3 討論

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改善乳成分，在通過牛乳生產(chǎn)人乳中的一些成分改善牛乳品質(zhì)方面被認為有抑菌、殺菌作用和有助于嬰兒鐵的更新及鐵向黏膜細胞轉(zhuǎn)運的人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因牛已經(jīng)研究成功，荷蘭Gen Pharm公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)人乳鐵蛋白，預(yù)計每年從乳中提煉出營養(yǎng)奶粉的價值為50億美元[5]。α-乳白蛋白被認為是乳糖合成酶的一個亞基，控制著乳中乳糖的含量，理論上如果乳腺能夠合成更多的乳糖，產(chǎn)乳的體積也會有相應(yīng)比例的增加。因此，增加乳中α-乳白蛋白的含量很有價值。目前已有研究將牛α-乳白蛋白基因在轉(zhuǎn)基因豬和轉(zhuǎn)基因小鼠中進行了表達，結(jié)果均引起了乳產(chǎn)量的增加[6，7]。另外，乳腺上皮細胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，是制作乳腺生物反應(yīng)器的靶細胞，因此可以利用體外培養(yǎng)的、能合成和分泌乳蛋白的乳腺上皮細胞來檢測特異性表達載體的功能，具有方便、快捷且真實反映乳腺在體內(nèi)表達水平的功能[8]。本實驗在純化鑒定的穩(wěn)定的奶牛乳腺上皮細胞中，進行了人α-乳白蛋白基因的表達研究，結(jié)果產(chǎn)生了具有活性的人α-乳白蛋白，為以后在牛乳中生產(chǎn)人α-乳白蛋白，增加乳中乳糖的含量和乳產(chǎn)量，提高牛奶的營養(yǎng)價值，進行了準備研究。試驗結(jié)果表明培養(yǎng)純化的牛乳腺上皮細胞能夠很好的表達外源基因，可進行相關(guān)的表達研究，可為以后制備乳腺生物反應(yīng)器、研究泌乳機制及泌乳調(diào)控機制提供基礎(chǔ)。

[1] 汪玉松,鄒思湘.乳生物化學(xué)[M].長春：吉林大學(xué)出版社,1995.

[2] 劉思國,魏影允,胡國法,等.人α-乳白蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中動態(tài)表達圖貌[J].中國科學(xué)：C緝,2003,33(4):317-322.

[3] MCKENZIE H A,WHITE F H,STINNAKRE M G,et al.Studies on a Trace Cell Lytic Activity Associated with Alpha-Lactalbumin[J].Biochem Int,1987,14(2):347-356.

[4] HAKANSSON A,ZHIVOTOVSKY B,ORRENIUS S,et al.Apoptosis Induced by a Human Milk Protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(17):8064-8068.

[5] VAN,WELLING M M,GEERTS M,et al.Large Scale Production of Recombinant Human Lactoferrin in the Milk of Transgenic Cows[J].Nat Biotechnol,2002,20(5):484-487.

[6] BLECK G T,WHITE B R,MILLER D J,et al.Production of Bovine Alpha-lactalbumin in the Milk of Transgenic Pigs[J].J Anim Sci,1998,76(12):3072-3078.

[7] BOSTON W S,BLECK G T,CONROY J C,et al.Short Communication:Effects of Increased Expression of Alpha-lactalbumin in Transgenic Mice on Milk Yield and Pup Growth[J].J Dairy Sci,2001,84(3):620-622.

[8] XU M N,LI S G,ZHAO J Y,et al.The Detection Method of Mammary Gland Bioreactor Expression Vector[J].Biotechnol Bull,2003,5:23-26.

Construction of human alpha lactalbumin expression vector and its expression in bovine mammary epithelial cells

ZHANG Li，LI Qing-zhang，TIAN Lei，CUI Ying-jun，ZHAO Bing，LV Ying，
GAO Xue-jun，JIANG Yu-jun
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The expression vector hα-LA–psv including human alpha lactalbumin 0.76 kb cDNA gene sequence was successfully constructed and transfected into the bovine mammary epithelial cells.The production of human alpha lactalbumin was 0.85mg/mL approximately.The results indicate that the expression vector can express alpha lactalbumin in bovine mammary epithelial cells effectively.

human α-LA；gene expression；bovine mammary epithelial cells

TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0004-02

2010-10-15

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No.11511027)；黑龍江省博士后基金(LBH-Z09270)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動基金(190106)資助。

張莉（1978-），女，副教授，主要研究方向為泌乳生物學(xué)與乳腺功能調(diào)控。