響應面法優化產丙酸桿菌素菌株的培養條件

王海晶，王玉華，齊斌

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，長春130118；2.常熟理工學院發酵工程技術研究中心，江蘇常熟215500；3.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟215500）

響應面法優化產丙酸桿菌素菌株的培養條件

王海晶1，王玉華1，齊斌2，3

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，長春130118；2.常熟理工學院發酵工程技術研究中心，江蘇常熟215500；3.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟215500）

響應面法已成功運用于發酵過程的優化，可以對發酵培養基及培養條件等諸多因素進行考察和評價，從而有效地確定重要因子的最優水平，取得更好的發酵效果，因此本文主要采用響應面法對丙酸桿菌素產生菌株的發酵培養基進行優化，以提高丙酸桿菌素抑菌能力。首先采用Plackett-Burman(PB)試驗設計法篩選出3個主要因素為葡萄糖、Tween80和pH值，然后通過最陡爬坡法和響應面分析方法確定主要因素的最佳質量濃度分別為：葡萄糖2.32 g/L，Tween80 0.1 g/L，pH值為7.0。在優化條件下丙酸桿菌素抑菌能力增強，形成的抑菌圈直徑是24.76 mm，是優化前的1.25倍。

丙酸桿菌素；Plackett-Burman試驗；最陡爬坡法；響應面分析方法

0 引言

乳品丙酸桿菌是一種存在于發酵乳制品中的革蘭氏陽性益生細菌，被認為是安全的菌種[1]，它能夠利用乳酸合成丙酸、乙酸、VB12、葉酸[2]、生物素和細菌素。丙酸桿菌細菌素是乳品丙酸桿菌代謝過程中合成的一種重要的多肽或蛋白質，它能抑制乳品中革蘭氏陽性細菌的生長并殺死乳品中的霉菌和酵母，從而抑制乳制品變質[3]，目前已經報道的有6種[4-8]。

近年來人們對丙酸桿菌的益生作用進行了大量研究[9-13]。但由于產量低，還未見大規模生產應用的報道，因此提高丙酸桿菌素產量、降低生產成本成為研究的重點。本文在初步優化基礎上，采用Plackett-Burman設計法和響應面法相結合的方法對Propionibacterium feudenreichi變異菌株培養條件進行優化，為丙酸桿菌素進一步工業化生產提供理論參考。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌種

丙酸桿菌Propionibacterium feudenreichii變異菌株CS01；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）：ATCC25923。

1.1.2 培養基

種子培養基：乳酸鈉20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4為1 g/L，MgSO4為0.2 g/L，Tween80為1 g/L，pH值為7.0。

發酵培養基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4為1 g/L，MgSO4為0.2 g/L，Tween80為1 g/L，pH值為7.0。

檢測培養基：上層為牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂10 g/L，pH值為7.0；下層為瓊脂20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 丙酸桿菌素溶液的制備

將100 mL丙酸桿菌發酵液4℃，8 000 r/min的條件下離心5 min，在上清液中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末，硫酸銨終質量分數為70%，繼續攪拌均勻，放于4℃冰箱中沉淀過夜，4℃，轉速為12 000 r/min的條件下離心15 min，沉淀物加入少量水溶解后，4℃透析48 h，每隔4 h換水1次，再將透析液冷凍干燥，向凍干物中加入100 mL蒸餾水，充分溶解，制成丙酸桿菌素溶液。

1.2.2 抑菌實驗

改進的牛津杯-雙層平板法[14]。

金黃色葡萄球菌懸液的制備：向37℃培養18 h的金黃色葡萄球菌斜面中加入5 mL無菌生理鹽水，將菌落洗下，再用無菌生理鹽水稀釋成濃度為1.18×107mL-1的指示菌懸液。

檢測平皿的制備：在無菌平皿中倒入10 mL已融化的瓊脂，凝固后，放入無菌牛津杯（不宜放置太多），將已融化的7.5 mL檢測培養基冷卻到50℃左右，加入100 μL指示菌懸液，快速充分混勻，倒入平皿，待其凝固。

抑菌活性檢測：向牛津杯中加入200 μL丙酸桿菌素溶液，將檢測平皿放置在37℃培養箱培養12 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.3 培養條件優化

Plackett-Burman（PB）實驗：在單因素實驗的基礎上，本研究選取酵母膏，葡萄糖，KH2PO4，Tween80，發酵時間，pH值，發酵溫度，接種量作為PB試驗的9個因素，每個因素取兩個水平，采用SAS軟件進行試驗設計、數據回歸分析以及建立多項式模型方程，選定出3個主要因素。

最陡爬坡實驗[15]：利用最陡爬坡法使PB實驗中得到的主要因素逼近最大響應面區域。

響應面法：以Plackett-Burman試驗中獲得重要因素作為響應面優化的因素，以丙酸桿菌素抑菌圈直徑為響應值（Y1），進行中心組合設計并采用SAS軟件進行試驗設計，數據回歸分析以及建立多項式模型方程，確定主要因素的最優濃度水平。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗結果

表1為Plackett-Burman實驗設計及結果。由表1的結果確定出對產物形成抑菌圈直徑影響因素最大的3個主要因素：pH值、葡萄糖、Tween80。

表1 Plackett-Burman實驗結果

主要因素的編碼多元一次回歸方程為

Y=16.34167-1.308333X1+1.475X3+2.291667X7（1）

該方程相關性R2=94.28%，該模型的相關性較好。可以作為以下實驗的依據。

2.2 最陡爬坡實驗設計和實驗結果

表2為最陡爬坡實驗設計及結果。由表2可以看出，在0階段組合實驗所測抑菌圈直徑最大，達到22.7 mm，所以將該組數據作為響應面實驗的中心實驗點。

表2 最陡爬坡實驗結果

2.3 響應面優化實驗

表3為實驗因素水平及編碼。根據表3水平及編碼，設計實驗并測量響應值，結果如表4所示。表5為回歸系數顯著性檢驗。

表3 實驗因素水平及編碼

根據實驗結果，并利用SAS分析軟件進行回歸分析，通過t分布和P值來檢驗各個系數的顯著性，考察這3個因素是否有交互作用。P值越小，系數越顯著。由表5可以看出，X1和X3對Y1影響顯著，X2對Y1影響不顯著。二次項對Y1的影響的顯著。在交互項上兩者的交互作用不顯著。即這3個因素之間的交互作用影響較小。表6為回歸方程方差分析結果。

表6結果表明：X1，X3，X12，X22，X32項影響是極為顯著(P＜0.01)；由此所建立的模型也是極為顯著(P＜0.01)；X2，X1X2為顯著(P＜0.5)，其中X22的影響較為突出；X2X3影響不顯著(P＞0.5)。因此各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次拋物面關系。模型可信度分析如表7所示。

表4 中心組合實驗設計及實驗結果

表5 顯著性檢驗結果

利用SAS分析軟件分析得到真實值的回歸方程：

對以上方程進行分析，回歸方程R2=95.32%，該方程的擬合效果較好，可信度高。可以將該方程用于模擬實驗結果分析。

2.4 響應面三維圖和對應等高線圖

圖1為運用SAS軟件分析得到的等高線圖和響應面圖，從圖中可以清晰地看出，各因子對響應值的影響變化趨勢和模型存在最大值（即穩點）。

表6 方差分析結果

表7 模型可信度分析

圖1 響應面三維圖和對應等高線

為了求出穩點對應的編碼值，對回歸方程取一階偏導得

解得：X1=0.87，X2=0.17，X3=0.64。即穩定點(X1，X2，X3)的代碼值為(0.87，0.17，0.64)。這說明X1（pH值）的最佳范圍在6.94左右，X2（Tween80質量濃度）的最佳范圍在0.09 g/L左右，X3（葡萄糖濃度）的最佳范圍在2.32 g/L左右，此時抑菌圈直徑的最大估計值Y=24.83 mm。考慮到實際操作的便利，確定pH值為7.0，Tween80質量濃度為0.1 g/L，葡萄糖質量濃度為2.32 g/L。

為了證實預測的結果，用以上得到的最優配方重復實驗5次。抑菌圈直徑分別為24.6，24.9，24.7，25.0，24.6 mm。驗證實驗所得抑菌圈平均值24.76 mm與估計值Y=24.83 mm相差不大，說明回歸方程較真實的反映了各因素對代謝物活性的影響，即提供了一個適合的模型。

3 結論

本文通過Plackett-Burman(PB)試驗設計法，篩選出了3個主要影響因子為葡萄糖、Tween80和pH值。采用最陡爬坡法和響應面分析方法(RSM)確定其最佳質量濃度分別為：葡萄糖2.32 g/L，Tween80 0.1 g/L，pH值7.0。因此最終確定最佳培養基組分和培養條件：葡萄糖2.32 g/L，酵母膏1.0 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.02 g/L，Tween80 0.1 g/L，pH值為7.0，接種量5%，培養溫度30℃，培養時間為9 d。在優化培養基條件下發酵并對抑菌能力進行檢測，所形成的抑菌圈直徑是24.76 mm是優化前的1.25倍。

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Optimization of propionin production by Response Surface Method

WANG Hai-jing1,WANG Yu-hua1,QI Bin2,3
(1.School of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118，China；2.School of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500，China；3.The Key Laboratory of Food and Biotechnology,Changshu 215500，China)

Fermentation process were optimized by using Response Surface Analysis method,the fermentation medium and the cultural conditions can be Examined and evaluated,optimal levels of the variables also can be defined,then the Fermentated activity can beimproved,the fermentation medium for propionin production was optimized by this methed in order to improve the inhibitory activity of propionin.Firstly,three statistically significant parameters including glucose,tween80,pH were identified by Plackett-Burman design.The optimal levels of three variables were defined by Steepest ascent method and Response surface method(RSM):glucose 2.32 g/L,tween80 0.1 g/L,pH 7.0.The inhibitory activity under the optimal fermentation medium can be improved.The diameter of inhibition zone was 24.76 mm,which was as 1.25 times as that under the original fermentation medium.

propionin;Plackett-Burman(PB);steepest ascent;Response Surface Method(RSM)

Q93.335

A

1001-2230（2011）02-0013-04

2010-09-30

蘇州市科學技術局資助項目（SNG0925），江蘇省“六大人才高峰”項目資助。

王海晶(1985-)，女，碩士研究生，食品微生物和功能性食品。

齊斌