乳酸乳球菌乳脂亞種高產丁二酮的條件優化

于田利，張佳程，范榮波，禇慶環

(青島農業大學食品學院，山東青島266109)

乳酸乳球菌乳脂亞種高產丁二酮的條件優化

于田利，張佳程，范榮波，禇慶環

(青島農業大學食品學院，山東青島266109)

分別研究了10種不同因素對乳酸乳球菌乳脂亞種產生丁二酮質量分數的影響。結果表明，各因素產生丁二酮最高量的條件：培養溫度為37℃；凝乳后3 h；后熟12 h；培養基pH值調至為5.6；培養基中添加檸檬酸氫二銨的質量濃度為0.15%；培養基中添加Vc的質量濃度為0.3%。培養基中添加金屬離子的質量濃度分別為：Mg2+為0.05%，Cu2+為0.04%，Mn2+為0.001%；培養基中添加甘氨酸的質量濃度為1.7%（均為質量分數）；培養基中添加碳水化合物的質量濃度分別為：葡萄糖為1%，蔗糖為1.5%（均為質量分數）；隨著基質濃度增加丁二酮產量也隨之增加。

乳酸乳球菌乳脂亞種；丁二酮；優化

0 引言

丁二酮，是一種黃色至淺綠色液體，稀釋至1 mg/L時呈奶油香味[1，2]。在發酵乳制品的滋味與香味中，丁二酮被認為是起作用的重要化合物之一，是檸檬酸經一系列生化反應而合成的[3]。丁二酮具有抗菌作用[4]。作為食用香料，我國GB2760—1986規定允許食用，美國食品和萃取協會(FEMA)安全號為2008[5]。

代謝產生丁二酮的微生物很多，所有V-P反應呈陽性的微生物都可產生丁二酮[6]。

本實驗主要通過單因素實驗，研究乳酸乳球菌乳脂亞種(L.lactis subsp.cremoris)的培養溫度及時間，后熟，培養基的pH值，在培養基中添加金屬離子（Mg2+、Mn2+、Cu2+），Vc，檸檬酸氫二銨，不同碳源（葡萄糖、蔗糖），甘氨酸和培養基基質濃度對乳酸乳球菌乳脂亞種產丁二酮的影響，提高產丁二酮的能力，為酮香型酸奶的生產作準備。

1 實驗

1.1 材料與儀器

乳酸乳球菌乳脂亞種(L.lactis subsp.cremoris)，完達山脫脂乳，液體MRS培養基（1L），蛋白胨10 g，K2HPO42 g，肉膏10 g，乙酸鈉5 g，酵母提取物5 g，吐溫80 1 mL，檸檬酸二銨，MnSO4·4H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O，葡萄糖20 g，pH值為6.2～6.4，121℃滅菌15 min，乳酸，甘氨酸，MgSO4，MnSO4，CuSO4，Vc，檸檬酸鹽，葡糖糖，蔗糖，16%三氯乙酸，濃度為4 mol/L鹽酸，鄰苯二胺溶液。

隔水式電熱恒溫培養箱，電子天平，TU-1800PC紫外可見分光光度計，手提式壓力蒸汽滅菌器（YXQ.SG41.280），超凈工作臺(AIR TECH)SW-CJ-1F。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化和增值

配置質量分數為13%的脫脂乳，110℃高壓滅菌15 min，挑取乳酸乳球菌乳脂亞種接種到已滅菌的脫脂乳中，放到30℃恒溫培養箱中，直到活力穩定(活力＞13.4%)，凝乳質地均勻黏稠，可拉成長絲，無乳清分離，凝乳時間在15 h之內，可以單獨作為發酵劑使用。將活化好的發酵劑接種到液體MRS培養基中擴大培養。

1.2.2 生長曲線的測定

采用比濁法測生長曲線。準備72支試管，每支倒入5 mL的液體MRS培養基,121℃滅菌15 min，將擴大培養好的乳酸乳球菌乳脂亞種接種到其中的48支試管中，作為兩組平行試驗，其他24支作為空白對照。放置在30℃恒溫培養箱中培養；分別培養0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46 h后在波長600 nm處比色測定菌液的OD600值。

1.2.3 丁二酮的檢測方法

采用鄰苯二胺比色法，其原理是鄰苯二胺與雙乙酰反應生成2，3-二甲喹喔啉，該化合物在335 nm下有最大吸收峰。具體方法是三氯乙酸沉淀蛋白→離心→取上清液→加鄰苯二胺黑暗處放置30 min→加鹽酸→紫外分光光度計OD335。

1.2.4 雙乙酰標準曲線的建立[5]

（1）用微量進樣器吸取15 μL雙乙酰標準品，溶于蒸餾水中，并定容至500 mL。

（2）取14支編號的試管分成2排放置，并分別加0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12 mL的標準溶液各2支，分別用蒸餾水補足10 mL，取5.0 mL上述雙乙酰標準溶液加入質量分數為8%的三氯乙酸溶液，這樣雙乙酰標準溶液的質量濃度分別為0.0，3.0，6.0，9.0，12.0，15.0，18 mg/L。

（3）第一排試管中加入0.5 mL質量分數為1%的鄰苯二胺溶液，第二排試管不加為空白；搖勻后置于黑暗處放置30 min。

（4）反應完全后加入濃度為4.0 mol/L鹽酸終止反應，第一排試管加2.0 mL，第二排試管加2.5 mL，混勻后以第二排試管空白作為參比液，在335 nm波長下用石英比色皿測定吸光度值。

（5）以雙乙酰質量分數為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5 實驗條件優化

分別實驗研究培養溫度、時間、pH值、基質濃度、后發酵時間、添加金屬離子（Mg2+，Mn2+，Cu2+）、Vc、檸檬酸、甘氨酸、碳源（葡萄糖、蔗糖）對乳酸乳球菌乳脂亞種產丁二酮的影響。

2 結果與分析

2.1 乳酸乳球菌乳脂亞種的生長曲線

乳酸乳球菌乳脂亞種的生長曲線如圖1所示。

由圖1可以看出，接種6 h后乳酸乳球菌乳脂亞種即開始生長，進入指數期；接種8 h后進入穩定期。

2.2 丁二酮質量濃度標準曲線

按照前面方法繪制標準曲線，用微量進樣器取樣品15 μL,稀釋成質量濃度分別為0.0，3.0，6.0，9.0，12.0，15.0，18 mg/L，在335 nm波長下用石英比色皿測

圖1 乳酸乳球菌乳脂亞種的生長曲線

定吸光度值，結果如圖2所示。

圖2 丁二酮濃度標準曲線

由圖2可以看出，標準曲線的相關性較好，相關系數達到0.99以上。得到的回歸方程式y=0.0691x+0.0109。

2.3 培養溫度及凝乳后時間的影響

將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到滅菌后的13%脫脂乳中，接種量為3%；分別放到25，30，37℃的恒溫培養箱中培養，凝乳后，分別在0，3，6，9 h后，測丁二酮的產生量，結果如圖3所示。

圖3 不同溫度不同凝乳后時間的影響

由圖3可以看出，乳酸乳球菌乳脂亞種在37℃下培養呈現出明顯的優勢，且在凝乳后3 h產生丁二酮的質量濃度最高，達到8.769 mg/L。因此，選擇37℃為菌種培養的溫度。

2.4 后熟及pH值的影響

將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到已滅菌的13%的脫脂乳中，接種量為3%，放到37℃恒溫箱中培養，凝乳后，放到0～4℃冷藏箱中后熟，后熟時間分別為0 h，12 h，24 h后測丁二酮的質量濃度，結果如圖4所示。

圖4 后熟對產丁二酮的影響

同時配質量分數為13%的脫脂乳，滅菌后在無菌條件下用乳酸調節pH值分別為4.8，5.6，6.4，接入乳酸乳球菌乳脂亞種，放到37℃恒溫培養箱中培養，凝乳后，測丁二酮的產量，結果如圖5所示。

圖5 pH值對產丁二酮的影響

由圖4可以看出，后熟12 h后，丁二酮的產量最高，達到13.437 mg/L。這是由于后熟促進了丁二酮的產生，在12 h達到了高峰。由圖5可以看出，在pH值為5.6時丁二酮的產量最高，達到9.438 mg/L。由此得出乳酸乳球菌乳脂亞種產丁二酮的最佳pH值為5.6。

2.5 檸檬酸及Vc對產丁二酮的影響

將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到滅菌后添加了檸檬酸鹽的13%脫脂乳中，添加量分別為0，0.1%，0.15%，0.2%，放到37℃恒溫培養箱中培養，凝乳后測丁二酮的產生量，結果如圖6所示。

圖6 檸檬酸鹽的添加量對產生丁二酮的影響

同時將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到分別添加了0，0.01%，0.05%，0.1%,0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的Vc的滅菌脫脂乳中，放到37℃的恒溫培養箱中，凝乳后測丁二酮產生量，結果如圖7所示。

圖7 Vc的添加量對產生丁二酮影響

由圖6可以看出，可見檸檬酸鹽的質量濃度對產丁二酮有促進作用，這是因為乳酸乳球菌可利用檸檬酸產生丙酮酸，而丙酮酸可用來合成丁二酮，并且，檸檬酸的加入可部分的阻遏丁二酮還原酶的產生，最終使丁二酮高產。但當添加檸檬酸鹽的量為0.15%時，丁二酮的產量最大，達到13.661 mg/L。說明乳酸乳球菌乳脂亞種對檸檬酸鹽的濃度存在適當的最適范圍。

由圖7可以看出，當添加Vc的量為0.3%時產生丁二酮的量最高，達到13.153 mg/L?？梢奦c可促進乳酸乳球菌乳脂亞種產生丁二酮。

2.6 金屬離子對產丁二酮的影響

將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到分別添加了（0，0.05%，0.1%，0.15%）MgSO4，（0，0.01%，0.02%，0.03%，0.04%，0.05%）CuSO4和（0，0.001%，0.002%，0.003%，0.004%）MnSO4的滅菌脫脂乳中，放置到37℃的恒溫培養箱中培養，凝乳后測丁二酮的質量濃度，結果如圖8～圖10。

圖8 Mg2+對產生丁二酮的影響

由圖8可以看出，Mg2+是丁二酮產生的生長因子，當添加Mg2+的量為0.05%時丁二酮的產量最高，達到15.203 mg/L。而高質量濃度的Mg2+則抑制了丁二酮的產生。

由圖9可以看出，當添加Mn2+的量為0.001%時產丁二酮的量最高，達到17.522 mg/L。這是由于少量的Mn2+刺激對檸檬酸的利用，從而產生較多丁二酮，但是額外的Mn2+有副作用，可以降低丁二酮的產量[7]。

圖9 Mn2+對產生丁二酮的影響

圖10 Cu2+對產生丁二酮的影響

由圖10可以看出，當添加Cu2+的量為0.04%時，產生丁二酮的量最高，達到13.656 mg/L。

2.7 不同碳源對產丁二酮的影響

將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到分別添加了（0%，1%，2%，3%，4%）葡萄糖和（0%，0.5%，1%，1.5%，2%）蔗糖的13%的滅菌脫脂乳中，放置到37℃的恒溫培養箱中培養直至凝乳，凝乳后測丁二酮的產量，結果如圖11和圖12所示。

圖11 葡萄糖的添加量對生丁二酮的影響

圖12 蔗糖的添加量對產生丁二酮的影響

由圖11可以看出，當添加葡萄糖的量為1%時丁二酮的產量最高，達到17.038 mg/L。

由圖12可以看出，當添加蔗糖的量為1.5%時丁二酮的產量最高，達到13.632 mg/L。

2.8 不同甘氨酸添加量及基質質量分數對產丁二酮的影響

將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到分別添加了（0%，0.5%，0.8%，1.1%，1.4%，1.7%，2.0%）的甘氨酸的13%的滅菌脫脂乳中，放置到37℃的恒溫培養箱中直到凝乳，凝乳后測丁二酮的質量濃度，結果如圖13所示。

圖13 甘氨酸的添加量對產生丁二酮的影響

將乳酸乳球菌乳脂亞種接種到不同基質濃度中，分別調整質量分數為10%，13%，18%，20%，22%，24%，26%，放置到37℃的恒溫培養箱中培養直至凝乳，凝乳后測丁二酮的質量濃度，結果如圖14所示。

圖14 不同基質質量分數對產生丁二酮的影響

由圖13可以看出，當添加甘氨酸的量為1.7%時丁二酮的產量最高，達到10.566 mg/L。

由圖14可以看出，隨著基質質量分數的增加，丁二酮的產量一直呈上升趨勢。

3 結論

通過實驗得出，37℃培養，凝乳后3 h，在脫脂乳中外加加蔗糖量為1.5%，葡萄糖量為1%，檸檬酸量為0.15%，Vc量為0.3%，甘氨酸添加量為1.7%，pH值為5.6，MgSO4添加量為0.05%，MnSO4添加量為0.001%，CuSO4添加量為0.04%（均為質量分數），后熟時間為12 h時，乳酸乳球菌乳脂亞種產生丁二酮量最高，同時隨著基質質量分數的增大丁二酮的產量也呈上升趨勢。

[1] MECULLAGH E，HODELL B K.Vanadium Oxides as Regenerable Reagents in the Oxide of Butanone to Diacetyl[J].Appl Catala:General,1993(97):39-47.

[2] YASAKU T.Oxidation of Ketones over Metal Oxide Catalysts Diacetyl Synthesis over Coball Oxide Lanthanoid Oxide Catalysts[J].Chem Soc Japan,1987(8):2757-2762.

[3] LEE W.Production of Diacetyl(2,3 Butanediol)by Continuous Fermentation with Simultaneous Product Separation[D].USA:Purdue University,PhD the2sis,1991.

[4] 趙玲,王靜云,包永明，等.丁二酮高產菌株的選育及發酵動力學分析[J].生物技術,2007，17（5）：59-64.

[5] Code of Federal Regulations.Title 21,Part131.Milk and Cream[S].Office Fed,Reg.,Natl.Archiv.Rcords Admin.,Washington,D C，1990，152-154,161-168.

[6] 邵亞東.傳統發酵乳制品中乳酸菌產雙乙酰特性的研究[D].內蒙古農業學，2007.

[7] 孟祥晨,杜鵬,李艾黎，等.乳酸菌與乳品發酵劑[M].北京:科學出版社,2009:122.

Research on the optimization of producing Diacetyl of L.lactis subsp.cremoris

YU Tian-li,ZHANG Jia-cheng,FAN Rong-bo,CHU Qing-huan
(Department of Food,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

Study on the influence of producing diacetyl with different factors to Lactococcus lactis subsp.cremoris.It was found that,the best condition that producing high yield diacetyl is that culture temperature is 37℃;curd after3 h;after-ripening 12 h;medium adjusted pH to 5.6;medium added amount of citric acid 0.15%;medium add the amount of Vc 0.3%;medium added amount of metal ions were:Mg2+was 0.05%,Cu2+was 0.04%,Mn2+was 0.001%;medium added glycine was 1.7%;medium added carbohydrate content were:glucose 1%,sucrose 1.5%,and with increasing concentration of skim milk diacetyl yield increased.

Lactococcus lactis subsp.cremoris;Diacety;optimization

Q93-335

A

1001-2230（2011）02-0017-04

2010-11-15

于田利（1985-），女，碩士，研究方向為畜產品加工。