阪崎腸桿菌及與腸桿菌科其他細菌差異比較

高建新，傅松哲，龍慧,肖菊珍

（南昌市疾病預防控制中心，南昌330038）

阪崎腸桿菌及與腸桿菌科其他細菌差異比較

高建新，傅松哲，龍慧,肖菊珍

（南昌市疾病預防控制中心，南昌330038）

為進一步推動乳品企業(yè)對每批次嬰幼兒配方乳粉進行阪崎腸桿菌出廠檢驗，尋求準確，更加便捷、且檢測費用低廉的檢測方法。選擇3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用進行了研究，分離阪崎腸桿菌并對幾種常見的腸桿菌科細菌在5種腸道分離培養(yǎng)基上生物學特性反應差異比較，以及對3種方法所用的培養(yǎng)基分離鑒定結果進行比較。結果表明,3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用，觀察其不同形態(tài)特征及生物學特性反應后，可初步判別阪崎腸桿菌及腸桿菌科中不同的屬以及同屬不同種。3種用于分離鑒定阪崎腸桿菌方法，無統(tǒng)計學差異。該方法分離崎腸桿菌準確、操作便捷、且檢測費用低廉，有利于乳品企業(yè)對每批次產(chǎn)品進行阪崎腸桿菌監(jiān)控。

阪崎腸桿菌；腸桿菌科細菌；生物學特性差異比較

0 引言

在嬰幼兒配方乳粉中，腸桿菌科其他病原體也常有檢出，1988年Muytjens等報告說，來自35個國家的嬰幼兒配方乳粉中受的腸桿菌科細菌污染的占52.5%[2]。其中阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌的分離頻率最高[3]。

2003年，由Druggan-Forsythe-艾弗森發(fā)明了DFI顯色培養(yǎng)基[4]，該培養(yǎng)基利用5-溴-4-氯-3吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷，使阪崎腸桿菌在該培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出藍綠色反應。2007年艾弗森和Forsythe發(fā)現(xiàn)由于α-葡萄糖苷酶基因的變異，阪崎腸桿菌菌株也可以不表達α-葡萄糖苷酶活性[5]。

由于顯色培養(yǎng)基的局限性，本研究選擇伊紅美藍、麥康凱、山梨醇麥康凱3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用進行了研究，分離阪崎腸桿菌以及對幾種常見腸桿菌科細菌在5種分離培養(yǎng)基上生長情況及生物學特性反應差異進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

阪崎腸桿菌標準株ATCC295444，ATCC29004，CMCC45401，大腸埃希菌ATCC25922，陰溝腸桿菌CMCC45501，肺炎克雷伯氏菌CMCC46114，檸檬酸桿菌CMCC48021，變形桿菌CMCC49027，沙門氏菌ATCC50662，志賀氏菌CMCC51573。阪崎腸桿菌（6株），聚團腸桿菌NCCDC0919-21，非脫羧埃希氏菌NCCDC09190211菌株由本中心分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

伊紅美藍（EMB），麥康凱（MacConKey），山梨醇麥康凱（SorbitolMacConKey），微量生化管，結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA），顯色培養(yǎng)基（Xa-GicA、DFI）。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測分離鑒定

（1）樣品修復培養(yǎng)（前增菌）。無菌稱取100 g乳粉加入500 mL預熱45℃BP中，混勻，經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng)18-24 h。

（2）樣品腸道增菌培養(yǎng)。移取10 mL加入90 mL EE肉湯中，于36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h。

（3）樣品分離培養(yǎng)。取EE增菌肉湯培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種EMB，MacConKey，Sorbitol-MacConKey瓊脂平板各1塊，置36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h。觀察3種平板上的菌落形態(tài)及不同的生物學特性反應。

（4）生化鑒定。挑取單個可疑菌落分純或接種TSA鈄面，生化鑒定至種。

1.2.2 生物學特性反應差異比較

取本中心分離鑒定菌株及幾種常見腸桿菌科標準菌株純培養(yǎng)物，分段劃線于5種腸道分離培養(yǎng)基，對其形態(tài)及生物學特性反應差異比較。

1.2.33 種方法分離鑒定比較

應用行標、國標及本研究方法，對市場嬰幼兒配方乳粉抽檢，分離鑒定乳粉中阪崎腸桿菌，并對結果進行比較，統(tǒng)計學分折。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理采用SPSS11.5軟件進行。

2 結果

2.1 3種基礎腸道分離培養(yǎng)基上生物學特性

（1）阪崎腸桿菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色黏液狀，菌落較大，相鄰菌落之間易于融合。在MacConKey瓊脂平板上大小1.8～2.5 mm，呈淡粉色。在Sorbitol-MacConKey瓊脂平板上不發(fā)酵山梨醇，形成中等大小、圓形突起、邊緣整齊的淡黃色菌落。

（2）阪崎腸桿菌形態(tài)與染色。革蘭氏染色鏡檢為G一無芽孢短小桿菌，呈球桿狀或成對排列,有時亦可呈短鏈狀。

（3）阪崎腸桿菌生化特性。菌株觸酶陽性、氧化酶陰性、動力陽性、葡萄糖代謝類型(0/F)為發(fā)酵型(F)，IMViC：靛基質(zhì)-MR-VP+檸檬酸鹽+，在TSA鈄面上產(chǎn)黃色色素。做進一步生化鑒定，結果如表1所示。

表1 菌株進一步生化鑒定結果

2.2 在5種分離培養(yǎng)基上生物學特性比較

阪崎腸桿菌與幾種常見的腸桿菌科細菌在5種分離培養(yǎng)基上形態(tài)與的生物學特性比較表明；阪崎腸桿菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色黏液狀，在MacConKey瓊脂平板上呈淡粉色，在SorbitolMacConKey瓊脂平板上不發(fā)酵山梨醇，中等大小、圓形突起的淡黃色菌落。聚團腸桿菌與阪崎腸桿菌同屬于腸桿菌屬，在Mac-ConKey和SorbitolMacConKey平板上菌落形態(tài)與生物學特點與阪崎腸桿菌很相似，也同樣可產(chǎn)生黃色色素，但在EMB平板上有明顯差異，菌落呈紫紅色，邊緣整齊圓形突起，菌落約1.8～2.3 mm。陰溝腸桿菌在SorbitolMacConKey平板上呈發(fā)酵山梨醇紅色菌落，肺炎克雷伯氏菌在EMB平板上有黏液，在MacConKey和SorbitolMacConKey瓊脂平板上呈粉紅色、紅色菌落，大多數(shù)中間有黃色色素。大腸埃希菌在EMB平板上呈紫綠色,有金屬光澤,有黑心，沙門氏菌在EMB、Mac-ConKey均為無色，但在SorbitolMacConKey平板上呈紅色。志賀氏菌在這3種基礎分離培養(yǎng)基上為無色、細小，約1.0 mm。變形桿菌在EMB、MacConKey有遷延生長現(xiàn)象。Xa-GiaA、DFII二者為顯色培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌在此培養(yǎng)基上呈藍綠色反應。但非脫羧埃希氏菌也有藍綠色反應。如表2所示。

2.3 3種方法所用分離培養(yǎng)基結果比較

2008年對市場抽檢的39件嬰幼兒配方乳粉應用3種基礎腸道分離培養(yǎng)基與SN/T1632.1-2005行標所用Xa-GicA培養(yǎng)基，同時檢出陽性2件，陽性率5.13%。2009年對市場抽檢的23的件嬰幼兒配方乳粉，檢出陽性2件,陽性率8.70%。2010年1月～9月，對市場抽檢的27的件嬰幼兒配方乳粉，檢出陽性2件,陽性率7.40%。3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用與國標推薦所用DFI培養(yǎng)基及行標推薦所用Xa-GicA培養(yǎng)基，3種方法所用培養(yǎng)基檢測無統(tǒng)計學差異。見表3。

表2 幾種常見腸桿菌科細菌在5種分離培養(yǎng)基上生物學特性反應差異比較結果

表3 3種方法檢測阪崎腸桿菌結果比較

4 討論

（1）從嬰幼兒配方乳粉中分離腸道致病菌，第1個步驟對樣品進行修復培養(yǎng)。乳粉在生產(chǎn)加工過程中，致病菌易受到亞致死性損傷，緩沖蛋白胨水（BP）是由胨、肽氨基酸組成的緩沖體系，易于進入菌體細胞內(nèi)，有促進細菌修復生長的作用[6]。

（2）第2個步驟是腸道增菌培養(yǎng)，增菌培養(yǎng)基靈敏度高，分離培養(yǎng)目標菌的機率就大。我們在實驗室應用3種阪崎腸桿菌標準株，對兩種腸道增菌培養(yǎng)基(mLST-Vm、EE）進行增菌效果比較，經(jīng)10倍稀后，阪崎腸桿菌1個cfu的條件下，兩種增菌培養(yǎng)基增菌效果無差異。選擇EE腸道增菌肉湯培養(yǎng)便捷，滅菌后2～8℃冰箱保存，4周之內(nèi)可以使用[7]。

（3）在分離培養(yǎng)基選擇上應選用弱選擇性和強選擇性培養(yǎng)基各1種或鑒別培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，增加分離平板的種類。我們選擇3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用，凡腸桿菌科的細菌都能在此平板上生長，并能觀察其不同菌落形態(tài)特征及生物學特性反應，可初步判別腸桿菌科中不同的屬以及同屬不同種。EMB為弱選擇性培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色不規(guī)則粘液狀，此平板作為輔助觀察，不宜在此平板上挑取單個菌落。MacConKey為選擇性分離培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌在MacConKey瓊脂平板上呈邊緣整齊1.8～2.5 mm，淡粉色菌落，應用MacConKey平板可觀察腸桿菌科細菌乳糖發(fā)酵情況。SorbitolMacConKey可以作為鑒別培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌有不分解山梨醇的特性，挑取菌落應選擇在SorbitolMacConKey上淡黃色或無色菌落。經(jīng)應用結果表明；3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用，可選擇性分離到腸桿菌科的種，可初步判別腸桿菌科中不同的屬以及同屬不同種，再進一步進行生化鑒定。

（4）Xa-GiaA、DFI培養(yǎng)基，二者為顯色培養(yǎng)基。利用阪崎腸桿菌具有a-D-葡萄糖苷酶，在培養(yǎng)基中添加5-4氯-3-吲哚-a-D-吡喃葡萄糖苷，阪崎腸桿菌在此顯色培養(yǎng)基上呈藍綠色反應，優(yōu)點是菌落區(qū)分直觀，但也并不是唯一性的阪崎腸桿菌所具有的生物學特征。羅茂凰報道：痢疾志賀菌、非脫羧埃希氏菌，熒光假單胞希菌在Xa-GiaA平板上能產(chǎn)生藍綠色反應，陸崢也報道福氏志賀菌也同樣可產(chǎn)生藍綠色反應。

（5）3年來使用3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用分離阪崎腸桿菌，準確、便捷，且檢測費用低廉。按每個平板17 mL量計算，行標所用Xa-GiaA培養(yǎng)基平板價格35.42/個，國標所用DFI培養(yǎng)基平板價格20.32/個，我們選擇3種基礎腸道分離培養(yǎng)基組合應用，3塊平板價格共0.82元，更有利于乳品企業(yè)對每批次產(chǎn)品進行阪崎腸桿菌監(jiān)控。

[1] IVERSEN C.FORSYTHE S J.Risk profile of Enterobacter sakazakii,an emergent pathogen associated with infant milk formula[J].Trends of Food Science and Technology,2003,14:443–454.

[2] MUYTJENS H L,ROELOFS-WILLEMSE H，JASPAR G H.Quality of powdered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae.[J]J.Clin.Microbiol.1988,26,743–746.

[3] ESTUNINGSIH S,KRESS C,Hassan A A,et al.Enterobacteriaceae in dehydrated powdered infant formula manufactured in Indonesia and Malaysia[J].J.Food Prot,2006,69,3013-3017

[4] DRUGGAN P,FORSYTHE S J,IVERSEN C.The Druggan-Forsythe-Iversen agar(DFI),a chromogenic medium for the detection fo Enterobacter sakazakii.104th ASM General Meeting,New Orleans,LA.2004.

[5] IVERSEN C,FORSYTHE S J.Comparison of media for the isolation of Enterobacter sakazakii[J],Appl Environ Microbiol,2007,73(1):48-52.

[6] 高建新.盧兆蕓.肖菊珍.奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法[J].中國乳品工業(yè)，2009，37（5）：40-43.

[7] 高建新.陳海嬰.盧兆蕓.奶粉中一株阪崎腸桿菌的分離鑒定[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2010，37（1）：105-106.

[8] 中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準.SN/T1632.1-2005奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法第1部分：分離與計數(shù)方法[S].北京：中國標準出版社，2005.

[9] 中華人民共和國衛(wèi)生部食品安全國家標準.GB4789.40-2010食品微生物檢驗阪崎腸桿菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

Application of three cost-effective medium for the detection of Enterobacteriaceae

GAO Jian-xin,FU Song-zhe,LONG Hui,XIAO Ju-zhen
(Nanchang Center for disease control and prevention,Nanchang,330038)

Objective:To further promote the monitoring of Enterobacter sakazakii for each batch of infant formula,accurate,convenient,and low-cost detection method was developed.Methods:three kinds of culture media were combined to isolate E.sakazakii.Enterobacteriaceae and several common intestinal bacteria were cultured in 5 kinds of mediums,their biological characteristics were compared,the three methods(line standard,national standard,this method)were also compared with results of isolation and identification media.Results:Through the combination of eosin-methylene-blue,MacConkey and sorbitol-MacConkey media，the morphological and biological characteristics of different media was also observed.Based on these isolation mediums,Enterobacteriaceae can be distinguished into different genera and different species.Three methods used for isolation and identification of E.sakazakii without significant difference(value U=0.1009，P=0.908＞0.05).The methods is accurate and low-cost,easily-operated,beneficial to monitoring E.sakazakii of every batch of dairy products.

Enterobacter sakazakii;Enterobacteriaceae;different biological characteristics

Q93-331，Q93-335

A

1001-2230（2011）02-0024-03

2010-09-25

高建新（1954-），女，副主任技師，從事乳制品及食品微生物檢測工作。