病原芽胞桿菌幾丁質酶產生菌的篩選與活性鑒定

蔡亞君，桂　震，李　鋒，楊小俊

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病原芽胞桿菌幾丁質酶產生菌的篩選與活性鑒定

蔡亞君，桂震，李鋒，楊小俊

（武漢紡織大學 環境工程學院，湖北 武漢 430073)

通過特異引物PCR方法和水解圈活性法對62株蘇云金芽胞桿菌菌株、26株蠟狀芽胞桿菌菌株及18株球形芽胞桿菌菌株進行了幾丁質酶產生菌的篩選。所測蘇云金芽胞桿菌中除4株野生型菌株外均為陽性結果，蠟狀芽胞桿菌僅1株為陰性結果，球形芽胞桿菌全為陰性結果，且水解圈法觀察結果與PCR檢測結果一致。在此基礎上，通過DNS比色法對幾丁質酶產生菌株的幾丁質酶比活力也進行了測定。對這些具有致病性的病原芽胞桿菌幾丁質酶的研究對于研究其致病機理及對其進行遺傳改良具有重要的理論和實際應用價值。

幾丁質酶；蘇云金芽胞桿菌；蠟狀芽胞桿菌；球形芽胞桿菌；比活力；致病

幾丁質（chitin）為聚β-1，4-乙酰葡萄糖胺，是一種廣泛存在于自然界的直鏈狀高分子生物多聚體。自然界每年生成的幾丁質數以百億噸計，是儲量僅次于纖維素的天然聚合物。幾丁質是許多真菌細胞壁的主要成分，也大量存在于昆蟲或節肢動物的甲殼及昆蟲的中腸中。幾丁質酶（chitinase）可催化水解幾丁質的β-1,4糖苷鍵生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG），廣泛存在于微生物、植物、昆蟲和脊椎動物中，在環境保護和農業等方面有著廣泛的應用前景。至今，芽胞桿菌屬中已有環狀芽胞桿菌（），蠟狀芽胞桿菌（，簡稱），蘇云金芽胞桿菌（，簡稱）等相繼發現產幾丁質酶的菌株。

是目前世界上應用最廣泛的生物殺蟲劑，在多種害蟲的綜合防治中發揮了重要的作用。與以及炭疽芽胞桿菌（.，簡稱）關系緊密，它們具有相似的形態特征和較高DNA 同源性[1]。事實上，同、、蕈狀芽胞桿菌（.，簡稱）、假真菌樣芽胞桿菌（.）以及韋氏芽胞桿菌（.，簡稱） 已經被歸類于芽胞桿菌屬蠟狀芽胞桿菌群[2,3 ]。

考慮到與菌株間的同源性關系，我們對本實驗室保存的87 株蠟狀芽胞桿菌群菌株，包括62 株、26 株菌株進行了幾丁質酶活性的檢測及其活力的測定，另外也對在蚊蟲防治中廣泛應用的球形芽胞桿菌（，簡稱）的18株菌株同時進行了研究。對致病性病原芽胞桿菌幾丁質酶的研究對于研究其致病性及其遺傳改良具有重要的理論和實際應用價值。

1　材料與方法

1.1菌株

所有菌株為武漢病毒研究所蟲媒病毒媒介控制實驗室保存。

1.2培養基

LB液體培養基：1.0 %NaCl，1.0 %蛋白胨，0.5 %酵母粉，pH值為7.0；LB固體培養基：LB液體培養基中加入2 %瓊脂。

幾丁質酶誘導培養基：10 %膠體幾丁質（濕重），0.1 % (NH4)2SO4，0.3 % KH2PO4，0.1% MgSO4·7H2O，0.7% K2HPO4，0.05%檸檬酸鈉，0.02%酵母粉，pH值為7.0；幾丁質誘導平板：在上述誘導培養基中加入2. 0 %瓊脂粉。

膠體幾丁質的制備：將10 g幾丁質粉末投入180 mL濃鹽酸中，攪拌2 h溶解后再加入1 L預冷的95%乙醇，攪拌30 min后-20℃保存備用。使用時取10 mL液體先離心，沉淀用50 mL 0.1 M 磷酸鈉鹽緩沖液（pH7.0）洗滌三次后溶于9 mL 0.1 M 磷酸鈉鹽緩沖液（pH6.0）中，最后得到濃度約為100 mg/mL的膠體幾丁質。

1.3幾丁質酶基因檢測

根據Genbank中芽胞桿菌幾丁質酶基因全序列的高度保守序列，應用分子生物學軟件DNASTAR設計、上海申工生物工程技術服務有限公司合成了一對幾丁質酶基因部分序列擴增引物CHI1：5’-TTGGGTACTTTCCTTCGTGG-3’，CHI2：5’-CGTATTTGCTGCTGGGTCAT-3’。PCR反應體系為：模板（將新鮮活化的菌液離心收集候懸浮于適量ddH2O中，沸水浴10 min后迅速置于冰上冷卻10 min，離心取上清作為PCR模板）5 μL，10×Taq reaction buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTPs 0.5 μL，Taq polymerase 1 U，10 pM引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。擴增程序為：94 ℃預變性10 min，94℃變性30 sec，50℃退火3 min，72℃延伸3 min，循環28次后72℃延伸7 min。

1.4幾丁質水解活性檢測

菌株的幾丁質水解活性通過水解圈法進行檢測，即在幾丁質酶誘導平板上打直徑為0.5 cm的孔，取50 μL在30 ℃、200 r/min條件下LB 液體培養基過夜培養的各芽胞桿菌培養物加入孔中，30 ℃溫箱中先正置培養12 h 后再倒置培養72 h，0.1%剛果紅水溶液染色后觀察水解圈的有無及大小。

1.5DNS比色法測定產酶菌的酶活力

將菌種在30 ℃、200 r/min條件下LB 液體培養基過夜培養后的200 μL培養物加入至5 mL幾丁質酶誘導培養基中，30 ℃、200 r/min 培養72 h ，培養物12,000 r/min離心20 min，收集上清，參照劉銘等[4]通過DNS比色法測定酶活力大小，一個酶活力單位（U） 定義為合適溫度下每小時產生1 μg 還原糖的酶量。

2　結果與分析

2.1芽胞桿菌幾丁質酶基因PCR檢測

以CHI1/CHI2作為引物，通過PCR方法檢測本室芽胞桿菌中幾丁質酶基因的分布，結果發現，所有18株球形芽胞桿菌菌株（分別為菌株 IAB59，IAB763，IAB769，IAB872，IAB881，SD7001，LP1-G，CoK31，NRS1693，DaK64，2314-2，2317-2，LFB-Fricon 2711，CIP5125，NRS1184，ATCC-14577，2173，KellenQ）的幾丁質酶基因檢測結果均呈陰性，完全觀察不到PCR擴增帶（電泳圖片未顯示）；在26株蠟狀芽胞桿菌野生菌株中，僅有一株（B294）的PCR結果呈陰性，有2株（B505，B601）可見微弱的帶，而其余23株均能觀察到明顯的擴增帶（見表1）；在檢測的蘇云金芽胞桿菌31株標準血清型菌株和31株分離菌株中，除4株野生型菌株（PF31、PF33、PF35和PF38）檢測結果為陰性，H34血清型菌株擴增帶較弱外，其余菌株檢測結果均為明顯的陽性反應（見表1）。

圖1　Bacillus thuringiensis 菌株幾丁質酶活時相分析

2.2芽胞桿菌幾丁質水解活性檢測及活力測定

幾丁質水解活性圈檢測表明，在18株球形芽胞桿菌菌株中，完全觀察不到幾丁質水解現象；26株蠟狀芽胞桿菌野生菌株中，僅有一株（B294）完全不產生幾丁質水解活性，有6株（B182、B231、B234、B310、B449、B505）產生微弱的幾丁質水解活性，而其余19株均能觀察到明顯的幾丁質水解活性，其中有5株（B089、B126、B281、B424、B538）具有很高的與陽性對照菌株沙雷氏菌S3相當的幾丁質水解活性；在蘇云金芽胞桿菌中，除四株野生型菌株（PF31、PF33、PF35和PF38）外，其余27株野生型菌株和所有31株標準血清型菌株均能產生明顯的水解圈，其中，野生菌株Gr-9和H4標準血清型菌株T04A001的水解圈直徑最大（見表1）。

表1　致病芽胞桿菌產幾丁質酶活性分析總表

+: 陽性結果；－: 陰性結果。幾丁質水解活性: R (水解圈半徑) －r (孔半徑)；0: 無水解圈， 1: R-r≤1mm， 2: 1＜R-r≤2mm， 3: 2＜R-r≤3mm，4: 3＜R-r≤4mm，5: R-r＞4mm。

DNS比色法對蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌菌株進行了幾丁質酶比活力的測定（見表1）。在蠟狀芽胞桿菌中，B182、B290、B089和B582的幾丁質酶產量最高，分別為429、397、386、330 U/mL，與S3的幾丁質酶產量（406 U/mL）相當。在蘇云金芽胞桿菌中，H4血清型菌株T04A001的幾丁質酶產量較高（355 U/mL），本研究中作為PCR檢測和水解圈活性檢測陽性對照的IPS78菌株的幾丁質酶產量略低，為191 U/mL。

2.3產幾丁質酶菌株產酶特性分析

選取了菌株中的H4血清型菌株T04A001和野生型的HD392、Gr-9菌株繪制了其在幾丁質誘導培養基上生長時的產酶曲線（見圖1），同時時相鏡檢觀察各階段培養物的芽胞生長變化，發現幾丁質酶酶活在菌株的對數生長末期、芽胞初始形成期（12 h）達到最高，分別可達到496、413、393U/ml，此后芽胞形成并逐漸脫落，酶活也隨之開始逐漸下降。

3　討論

在本研究中，檢測的大部分蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌均含有幾丁質酶基因和不同程度的產生幾丁質酶，證明蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌普遍都能產生幾丁質酶。所用的PCR和水解圈的檢測方法結果一致，表明這兩種方法都具有很好的可靠性。水解圈的大小和我們根據DNS方法測定的幾丁質酶比活力結果并不完全一致，推測與測定幾丁質酶比活力時的取樣時間有關，如圖1中所測三株菌株的最高酶活均在12 h處，而到72 h時酶活已經降到了很低程度。而本研究中所用PCR方法中的所用引物參照的主要是蠟狀芽胞桿菌群菌株的幾丁質酶基因，且幾丁質水解活性的檢測方法也不一定適合球形芽胞桿菌，因此在球形芽胞桿菌未檢測到幾丁質酶活性，并不能說明所有球形芽胞桿菌都不能產幾丁質酶。

大量研究證明，外源幾丁質酶的加入對微生物殺蟲劑具有增效作用[5]；在蘇云金芽胞桿菌中表達幾丁質酶，使幾丁質酶與殺蟲晶體蛋白共表達，能提高對鱗翅目害蟲的毒力[6-8]。在幾丁質酶對雙翅目害蟲的研究方面，已證明幾丁質酶對埃及伊蚊具有微弱毒力[9]，且通過在球形芽胞桿菌中表達幾丁質酶，已顯著提高了球形芽胞桿菌對致倦庫蚊幼蟲抗性品系的抗性[10]，不僅對球形芽孢桿菌在蚊蟲防治中逐漸引起的抗性問題有了解決辦法，對于蘇云金芽胞桿菌在害蟲防治實際應用中逐漸嚴重的抗性問題也提供了解決思路。因此，本研究對病原芽胞桿菌幾丁質酶產酶菌株的篩選和活性測定對于病原芽胞桿菌在生物防治中的更好應用也具有重要意義。

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Chitinolytic ActivityDetection in Pathogenic Bacillus sp. Strains

CAI Ya-jun, GUI Zhen, LI Feng, YANG Xiao-jun

(College of Environmental Science and Engineering, Wuhan Textile University, Wuhan Hubei 430073, China)

The presence of chitinase gene and the chitinolytic activity among pathogenic Bacillus sp. strains have been detected by PCR method and chitinase activity assays. The results showed that no chitinase gene and chitinase production been observed in 1 of 26 Bacillus cereus strains, 4 of 62 B. thuringiensis strains and all 21 B. sphaericus strains. All other strains could produce chitinolytic activity during their growth. The investigation of chitinase-producing strains in pathogenic Bacillus sp. provide us more information for the research of Bacillus sp. strains’ pathogenesis and chitinase’ application potency in insect control.

Chitinase; Bacillus thurinngiensis; B.cereus; B.sphaericus chitinolytic activity; pathogenic

Q89

A

1009－5160(2011)03－0058－04

蔡亞君（1980-），女，博士，講師，研究方向：應用微生物遺傳改良.

武漢紡織大學校基金項目（2008Z24）.