不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖結構分析及其清除自由基能力的比較研究

趙 維，李建科

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710062)

不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖結構分析及其清除自由基能力的比較研究

趙 維，李建科*

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710062)

首次采用無水乙醇浸泡輔助脫乙酰基與間歇式堿處理相結合的方法，通過控制反應時間制備不同脫乙酰度的蠶蛹殼聚糖。同時對其脫乙酰度、表觀黏度和分子量等理化指標進行測定，用紅外光譜對其基本結構進行表征，并分別采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法、核黃素－光－氮藍四唑法和DPPH法對其清除羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(·)和DPPH自由基能力進行了測定。結果表明:當反應時間為5、7、9h時，蠶蛹殼聚糖的脫乙酰度分別為:78.12%、86.45%、95.96%;蠶蛹甲殼素和不同脫乙酰度殼聚糖的紅外光譜圖的不同說明其結構上的差異，可為進一步研究其性質提供理論參考;蠶蛹殼聚糖對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率均較低，但均高于蝦蟹殼來源的殼聚糖;對DPPH·的清除率較高。三種殼聚糖對三種自由基清除率的大小順序均為:脫乙酰度為95.96%的殼聚糖＞脫乙酰度為86.45%的殼聚糖＞脫乙酰度為78.12%的殼聚糖。

蠶蛹殼聚糖，不同脫乙酰度，結構分析，清除自由基能力

殼聚糖是天然存在的唯一堿性多糖甲殼素的脫乙酰產物。殼聚糖由于存在游離氨基，因而具有許多纖維素沒有的獨特性質，使得其在食品、醫藥、化工、環境等行業有著廣泛的應用［1］。蠶蛹富含油和蛋白質，蛹渣是蠶蛹提取油和蛋白質后的廢棄物，其中含有未被利用的甲殼素。由于蠶蛹中的灰分含量較少［2］，所以是提取甲殼素，進而制備殼聚糖的良好原料。目前，國內有關蠶蛹甲殼素及殼聚糖的研究多集中在制備工藝方面［3－5］，對其結構和性質的研究還不夠深入，雖然已有研究證明殼聚糖及其衍生物在細胞水平和動物整體水平上有一定的抗氧化作用［6］，但不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖的結構分析及其清除自由基能力的研究報告尚未見到，因此，很有必要對不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖的基本結構及其清除自由基的能力進行深入的研究探討，以期為蛹渣的利用開辟新途徑。本文首次采用無水乙醇浸泡輔助脫乙酰基與間歇式堿處理相結合的方法，通過控制反應時間制備不同脫乙酰度的蠶蛹殼聚糖，同時測試其脫乙酰度、表觀黏度和分子量等理化指標，用紅外光譜對其基本結構進行了表征，并對其清除羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O－2·)和DPPH·的能力進行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶蛹甲殼素 從提取油和蛋白的蛹渣中自制而得;NBT(氮藍四唑)、L－甲硫氨酸 上海沃爾森公司;DPPH(1，1－二苯基－2－苦基肼自由基) Sigma公司;核黃素 北京奧博星生物技術責任有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、冰乙酸、無水碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、甲基橙、鄰二氮菲、過氧化氫、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 均為國產分析純。

恒溫水浴鍋、電熱恒溫鼓風干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司;SC69－02C水分快速測定儀 上海第二天平儀器廠;SPJX－4－13箱式電阻爐 天津市中環實驗電爐有限公司;烏氏粘度計 上海申誼玻璃制品有限公司;RVDV－II+Pro粘度計 美國博利飛公司;2000型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器公司;Avatar360E.S.P.FTIR傅立葉變換紅外光譜儀 尼高力儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶蛹甲殼素的預處理 在反應前，采用蒸餾水浸泡30m in，避免產品顏色太深。

1.2.2 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖的制備 稱取1.00g蠶蛹甲殼素粉末原料于150m L錐形瓶中，加入15m L無水乙醇浸泡1.7h，然后再按1∶28(g/m L)的料液比加入質量分數為44%的NaOH溶液，攪拌均勻后，浸泡10m in，再放入94℃的水浴鍋中分別反應5、7、9h，期間每隔2h取出過濾，水洗至中性，換堿1次，反應完畢后取濾渣在60℃下干燥至恒重。

1.2.3 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖理化指標的測定

1.2.3.1 水分含量的測定 用水分快速測定儀進行測定。

1.2.3.2 灰分含量 采用干法灰化法，具體方法參考文獻［7］。

1.2.3.3 脫乙酰度的測定 采用酸堿滴定法，具體方法參考文獻［5］。

1.2.3.4 表觀黏度的測定 將0.4g殼聚糖樣品溶于40m L 1%乙酸溶液中，在25℃條件下進行測定，具體方法參考文獻［8］。

1.2.3.5 分子量的測定 測定殼聚糖特性黏度，根據Mark－houwink方程［η］=KMα計算分子量，其中:K=1.64×10－30×(D.D.×100)14，α =－1.02 ×10－2×(D.D.×100)+1.82，［η］為特性黏度，M 為分子量，具體方法參考文獻［8］。

1.2.3.6 殼聚糖產率的計算1.2.4不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖的紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法將樣品置于傅立葉變換紅外光譜儀下測其IR譜圖，測定波數范圍為500～4000cm－1，具體方法參考文獻［9］。

1.2.5 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖清除自由基能力的檢測 將不同脫乙酰度的殼聚糖樣品分別配制成不同質量分數的殼聚糖樣品溶液，采用以下方法檢測其清除自由基的能力。

1.2.5.1 清除羥自由基(·OH)能力的測定 采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法［11］，并對其進行改進。取2.0m L pH7.0的磷酸鈉緩沖液，加入1.5m L 5mmol/L鄰二氮菲應用液，充分混勻。再加入1.0m L 7.5mmol/L FeSO4溶液，立即混勻。加入1.0m L樣品溶液，立即混勻。加入3.5m L雙蒸水，以補充體積。最后加入1.0m L 0.1%H2O2溶液，混勻。于37℃水浴中保溫60m in，于536nm測定吸光值。羥自由基清除率d表示為:

式中，A0:不加樣品及H2O2時測得的吸光值;A1:加H2O2而不加樣品時測得的吸光值;A2:加入樣品及H2O2時測得的吸光值。

采用核黃素－光－氮藍四唑體系測定［12］，并對其進行改進。取1.0m L pH7.0磷酸鈉緩沖液，加入0.5m L 3.3×10－5mol/L核黃素，0.5m L 3 ×10－3mol/L 甲硫氨酸，2.25×10－4mol/L NBT和1.0m L樣品溶液。于光照箱上方安裝兩支30W日光燈，距密閉反應箱約20cm照射30m in后于560nm處測樣品吸光值A。以溶劑代替樣品溶液測得空白吸光值A0。超氧陰離子自由基(·)清除率d表示為:

1.2.5.3 清除DPPH·活性的測定 采用DPPH法［13］，并對其進行改進。在試管中加 2m L 5 ×10－5mol/L的DPPH無水乙醇溶液與2m L樣品溶液，混勻，在室溫下靜置30min后，于517nm處測得吸光值AI，同時測定2m L 5×10－5mol/L的 DPPH 無水乙醇溶液與2m L溶劑的吸光值A0，以及2m L樣品溶液與2m L溶劑的吸光值AJ。DPPH·的清除率d表示為:

2 結果與分析

2.1 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖指標成分的測定

選用以下制備工藝條件，即無水乙醇浸泡時間1.7h，NaOH溶液質量分數44%，處理溫度94℃，料液比 1∶28(g/m L)，分別反應 5、7、9h，所得殼聚糖產品各項指標成分見表1。

由表1可知，隨著處理時間的延長，殼聚糖產品的脫乙酰度升高，但表觀黏度、特性黏度和分子量也隨之下降，水分、灰分和產率的變化不大，樣品顏色均為原白色。其中，脫乙酰度為86.45%和95.96%的殼聚糖產品各項指標均符合相關企業食品級殼聚糖的標準［7］。

表1 不同脫乙酰度蠶蛹渣殼聚糖的指標成分

2.2 紅外光譜表征樣品化學結構

將蠶蛹甲殼素和不同脫乙酰度殼聚糖粉末作紅外光譜分析，結果見圖1。殼聚糖與甲殼素的紅外光譜差異表現在酰胺譜帶、氨基譜帶和氫鍵等方面。

3400cm－1左右的寬峰是O－H和N－H的伸縮振動吸收峰互相重疊而成的多重吸收峰，即對照于殘糖基上的 O－H 和 N－H［14］，這個峰還說明 O－H 和N－H之間存在著強弱不同的分子內和分子間氫鍵，3264cm－1左右的峰是N－H的伸縮振動吸收峰。由圖可知，蠶蛹殼聚糖樣品在3400cm－1左右的吸收峰不及甲殼素樣品的吸收峰型尖銳，而且甲殼素樣品在3446cm－1和3278cm－1處都有顯著的吸收峰，而殼聚糖樣品僅在3437～3447cm－1左右有吸收峰，這表明殼聚糖樣品分子內和分子間的氫鍵較未進行脫乙酰處理的甲殼素樣品弱。

1652cm－1左右的吸收峰歸屬于酰胺Ⅰ譜帶，反映的是乙酰氨基，1590cm－1左右的吸收峰屬于酰胺Ⅱ譜帶，是氨基的特征吸收峰，1590cm－1左右的吸收強度增強，表明氨基大量存在于殼聚糖樣品中，說明了脫乙酰反應程度較高［15］。從圖中可以觀察到殼聚糖樣品在1590cm－1左右出現了一個尖銳的吸收峰，而甲殼素樣品在1590cm－1左右的吸收峰很小，這說明當甲殼素脫乙酰反應生成殼聚糖時，1655cm－1左右峰的吸收強度減弱，1590cm－1左右峰的吸收強度增強，可以證明氨基大量存在于殼聚糖樣品中。殼聚糖在1590cm－1左右的吸收強度比1655cm－1處強，這說明該殼聚糖樣品的脫乙酰度高，這與上面理化指標的測定結果一致。1652cm－1左右的峰位也可以證明蠶蛹甲殼素及殼聚糖均為α型［16］。

不同脫乙酰度的蠶蛹殼聚糖的紅外光譜在整體上相似，僅在吸收峰的強度上表現出差異。由于殼聚糖分子中存在的分子內和分子間氫鍵的強弱和長短不等，因此，它們的伸縮峰出現在較寬的頻率范圍內。三種殼聚糖樣品在3400cm－1左右的吸收峰位置分別為:b:3437cm－1，c:3439cm－1，d:3447cm－1，峰位d＞c＞b，峰位向高頻區移動表明樣品的結晶度隨脫乙酰度的提高而增加［16］。三種殼聚糖樣品在該處的峰型尖銳程度是:d＞c＞b，說明樣品d含有的自由羥基多于c和b。

圖中2922～2882cm－1左右的吸收峰是殘糖基上的甲基或次甲基的C－H伸縮振動吸收峰。由圖可知，在該峰位的吸收強度及峰的尖銳程度均為:d＞c＞b，說明隨著殼聚糖脫乙酰度的增加，樣品在該峰位的吸收度也隨之增加。三種殼聚糖樣品在2900～2800cm－1左右的吸收峰位置分別為:b:2917cm－1，c:2884cm－1，d:2881cm－1，即:b ＞ c ＞d，說明隨著樣品脫乙酰度的增加，蠶蛹殼聚糖在該波段處的峰位偏向低頻，一般認為殼聚糖結晶度增加會使 C－H伸縮峰向低頻移動［16］，所以可以證明蠶蛹殼聚糖的結晶度隨著脫乙酰度的提高而增加。

1590cm－1左右的酰胺Ⅱ譜帶吸收峰的強弱可以反映殼聚糖脫乙酰度的高低。三種殼聚糖樣品在酰胺Ⅱ譜帶的吸收峰強弱為:d＞c＞b，說明d樣品的脫乙酰度最高。1425cm－1左右的吸收峰是蠶蛹殼聚糖的CH2彎曲變形的吸收峰，1381cm－1出現的吸收峰是CH振動和C－CH3變形峰。900～800cm－1出現的吸收峰是多糖的β構型糖苷鍵的特征峰，這證明蠶蛹殼聚糖的糖苷鍵是β構型。

圖1 蠶蛹甲殼素和不同脫乙酰度殼聚糖的紅外光譜圖

2.3 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖清除自由基能力的檢測

2.3.1 清除羥自由基(·OH)能力的測定 由圖2可知，隨著濃度的升高，所有樣品清除羥自由基的能力逐漸增強。在相同濃度下，隨著殼聚糖樣品脫乙酰度的提高，其對羥自由基的清除能力也隨之升高。這可能是由于高脫乙酰度的蠶蛹殼聚糖分子內自由羥基多于低脫乙酰度殼聚糖，而且其氨基含量也較多，羥基的氫原子與羥自由基作用而達到清除羥自由基的目的;氨基與羥自由基反應可以生成穩定的大分子自由基;氨基先與溶液中的氫作用形成氨正離子，再與羥自由基作用形成穩定物質［9］。這與其紅外光譜所表征的不同脫乙酰度殼聚糖結構的差異是一致的。三種殼聚糖對羥自由基的清除率都隨濃度的增大而增加，但清除率總體都不高。當脫乙酰度為95.96%的殼聚糖的濃度為8mg/m L時，其清除率為35.13%。但與以蝦蟹殼為來源的殼聚糖［19］相比，其清除率還是要高許多。

圖2 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖對羥自由基的清除能力

由圖3可知，當殼聚糖溶液的濃度相同時，殼聚糖的脫乙酰度越高，其對超氧陰離子自由基的清除率也隨之升高。這可能是因為較脫乙酰度低的殼聚糖而言，脫乙酰度高的殼聚糖其分子量相對較低，其分子鏈的纏繞程度相對較小，活性基團的暴露程度較高，與超氧陰離子作用的機會也隨之增多，從而反應活性相對較高，但整體上較低，最高的清除率僅為29.87%，這可能是因為其分子量整體上仍較大，暴露的活性基團還不夠多，若想進一步提高殼聚糖清除超氧陰離子自由基的能力，可對其進行降解，有待進一步研究。由圖3還可以發現，在低濃度處，三種樣品的清除率差別較小。當溶液濃度達到3.5mg/m L時，不同脫乙酰度殼聚糖對超氧陰離子自由基的清除率大小差異明顯，當溶液濃度大于5mg/m L時，c號樣品的清除率趨于平穩，a號和b號樣品的清除率處于一直增大的趨勢。盡管總體的清除率都不高，但與其它來源的殼聚糖9.32%的清除率［9］相比，還是要高很多。

圖3 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖對超氧陰離子自由基的清除能力

2.3.3 清除DPPH·能力的測定 由圖4可知，三種不同脫乙酰度殼聚糖對DPPH·的清除率均隨著濃度的增加而增大。當溶液濃度為0.5mg/m L和2mg/m L時，不同脫乙酰度殼聚糖對超氧陰離子自由基的清除率大小差異不明顯，當溶液濃度超過2mg/m L時，這種差異才顯現出來。在相同濃度下，三種樣品對DPPH·的清除率大小順序為:c＞b＞a，說明殼聚糖對DPPH·的清除率隨著脫乙酰度的增加而增大。這是因為DPPH·是一種穩定的自由基，它可以接受電子和氫形成穩定的分子。由紅外圖譜可以發現脫乙酰度高的殼聚糖溶液中含有更多的氨基和羥基，因此其可以提供更多的電子和氫與DPPH·結合從而達到清除的目的。

圖4 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖對DPPH自由基的清除能力

3 討論

目前，國內有關蠶蛹甲殼素及殼聚糖的研究多集中于制備工藝方面，不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖的結構分析及其清除自由基能力的研究報告還尚未見到。通過研究蠶蛹甲殼素和不同脫乙酰度的殼聚糖的紅外光譜圖之間的差異，可為進一步研究其性質提供理論參考。

在三種殼聚糖清除自由基能力檢測的研究中，發現無論哪種脫乙酰度的殼聚糖，在相同濃度時對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率均較低，而對DPPH自由基的清除率則相對較高。如在濃度為8mg/m L時，脫乙酰度為95.96%的殼聚糖對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率分別為:35.13%、29.87%和90.92%，差異較大，其中原因有待進一步探討研究。

4 結論

4.1 以蠶蛹甲殼素為原料，選用以下制備工藝條件，即無水乙醇浸泡時間1.7h，NaOH溶液質量分數44%，處理溫度94℃，料液比1∶28(g/m L)，分別反應5、7、9h，可得脫乙酰度分別為 78.12%、86.45% 和95.96%的殼聚糖。

4.2 不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖紅外光譜圖的不同表明其結構上的差異，可為殼聚糖性質的研究提供參考。

4.3 在相同濃度下，三種脫乙酰度蠶蛹殼聚糖對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH·的清除率的大小順序為:脫乙酰度為95.96%的殼聚糖＞脫乙酰度為86.45%的殼聚糖＞脫乙酰度為78.12%的殼聚糖。三種不同脫乙酰度的殼聚糖在相同濃度時對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率均較低，但高于蝦蟹殼來源的殼聚糖;對DPPH自由基的清除率則較高。

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Structural characterization of different deacetylated degree chitosan from silkworm chrysalis residue and its scavenging free radical abilities

ZHAO Wei，LI Jian－ke*

(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

By controlling treatment time，different deacetylated degree chitosan was prepared from silkworm chrysalis chitin with a method combining absolute alcohol soaktime with intermittent type treatment to deacetylate for the first time.The deacetylated degree，apparent viscosity，molecular weight and some relevant typical properties of products were determined.Their basic constitution was charactered by FTIR.1，10－phenanthroline－Fe2+oxidative assay，riboflavin photodegradation－－NBT reduction method and DPPH method were used to evaluate scavenging abilities of chitosan to free radical including hydroxyl radical，superoxide anion radical and DPPH radical.The results were as follows:when treatment time were 5，7，9h，deacetylated degree of chitosan were 78.12%，86.45%，95.96%，respectively.Infrared spectrogram of chitin and different deacetylated deg reechitosan had significant difference，which could provide some reference for properties and application research of produc ts.Scavenging rate of different deacetylated deg reechitosan from silkworm chrysalis to hydroxyl radical and superoxide anion radical were low，but were higher than that of chitosan from shrimps and crabs.Scavenging rate of different deacetylated degree chitosan to DPPH radical was high.The orders of scavenging rate of different deacetylated degree chitosan from silkworm chrysalis to three free radicals were chitosan whose deacetylated degree was 95.96%＞chitosan whose deacetylated degree was 86.45%＞chitosan whose deacetylated deg ree was 78.12%.

chitosan from silkworm chrysalis;different deacetylated degree;structural characterization;scavenging free radical abilities

TS201.2+3

A

1002－0306(2011)08－0090－05

2010－07－12 *通訊聯系人

趙維(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:營養與食品衛生。

陜西省“13115”科技創新工程重大科技專項項目(2009ZDKG－05)。