超聲波及熱處理對柚皮苷酶穩定性及其二級結構的影響

曾霖霖，黃惠華

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640)

超聲波及熱處理對柚皮苷酶穩定性及其二級結構的影響

曾霖霖，黃惠華*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640)

研究了超聲波及熱處理對柚皮苷酶的活性及熱穩定性的影響，通過圓二色譜分析超聲波及熱處理對柚皮苷酶二級結構的影響。結果表明，隨著溫度的升高，酶失活速率加快，在80℃下保溫150min，柚皮苷酶殘留酶活僅為原酶的15.69%。超聲功率為40～120W時，短時間的超聲處理對柚皮苷酶活性有促進作用，而功率大于160W時超聲波處理對柚皮苷酶活性有鈍化作用。80W處理對柚皮苷酶的熱穩定性有促進作用，處理5min后60℃保溫150min，酶活性比未經處理的柚皮苷酶活性增加了64.34%;而280W處理對柚皮苷酶的熱穩定有鈍化作用，處理40min后60℃保溫150min，酶活性比未經處理的柚皮苷酶活性降低了42.61%。圓二色譜分析結果表明，未經處理的柚皮苷酶中α－螺旋含量較少，主要結構為β－折疊和無規則卷曲;熱處理及超聲波處理對α－螺旋結構幾乎沒有影響，β－折疊、β－轉角及無規則卷曲含量的變化分別在0.4%～1.1%、0.1%～0.4%及0～0.9%之間。

柚皮苷酶，超聲波，熱處理，圓二色譜，二級結構

柚皮苷酶首先被Hall和Thomas分別于1938年和1958年從芹菜種子和葡萄果實的葉子中分離出來。然而，只有經過微生物培養分離出的柚皮苷酶才是可以應用的，該產品可經過液體深層發酵法或固體發酵法獲得［1］。柚皮苷酶主要應用于果汁的脫苦，它是由α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶組成的混合酶系，兼具兩種酶的活性。前者可將果汁中黃烷酮糖苷類化合物的柚皮苷水解成櫻桃苷和鼠李糖，櫻桃苷的苦味約為柚皮苷的1/3;櫻桃苷接著在β－D－葡萄糖苷酶的作用下生成無苦味的柚皮素和葡萄糖［2－3］，苦味消失。因此研究不同處理后柚皮苷酶穩定性及二級結構的變化，對提高果汁的脫苦率具有非常重要的意義。目前國內外關于柚皮苷酶穩定性及二級結構的研究還未見報道，本文研究了超聲波及熱處理對柚皮苷酶穩定性的影響，并通過圓二色譜儀分析柚皮苷酶二級結構的變化，以探討熱處理及超聲波處理與柚皮苷酶二級結構變化之間的關系，為促進柚皮苷酶的工業化應用提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

柚皮苷酶 來源于青霉屬，活力414U/g(酶活定義:在40℃、pH為4.0的條件下每分鐘從柚皮苷中分解出1.0μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個活力單位)，購于sigma公司;柚皮苷 購于sigma公司。

圓二色譜儀(MOS－450) Blo－Logic公司;JY92－IIDN超聲波 寧波新芝;UV－1800紫外可見分光光度計 日本島津;恒溫水浴鍋 HH－4富華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚皮苷酶溶液中蛋白含量的測定

1.2.1.1 標準曲線的制作 以牛血清白蛋白為標樣，取0.5g標樣溶于50m L蒸餾水，配成10mg/m L牛血清白蛋白溶液。取6支試管，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L標液，用蒸餾水補足至1m L，分別加入4m L堿性硫酸銅溶液(由1.5g硫酸銅、6.0g酒石酸鉀鈉溶于500m L蒸餾水中，攪拌下緩慢加入300m L 10%的 NaOH溶液，定容至1L)，振搖10min，靜置30m in后在500～600nm范圍內快速掃描，得產物最大吸收波長為543nm。然后在543nm處測定反應液的吸光值，以吸光度對蛋白質的含量作圖，繪制標準曲線，得到回歸方程為 y=0.2373x+0.0075，R2=0.9982。

1.2.1.2 樣品測定 取5支試管，分別加入1.0m L 5mg/m L的酶液，振蕩10m in，靜置30min后在543nm處測定吸光度，根據吸光度計算所取樣液中蛋白質含量。結果表明，柚皮苷酶中蛋白質含量為32.68%。

1.2.2 柚皮苷酶活力測定方法［4］取2m L 0.1%柚皮苷標準溶液和0.2mol/L pH3.8的檸檬酸緩沖液1.9m L置于試管中，在40℃恒溫水浴中預熱5m in，然后加入未處理及處理過的柚皮苷酶液0.1m L，充分搖勻，準確保溫30m in，用三氯乙酸滅酶后吸取0.5m L酶解液，置于10m L的小試管中，加入90%二甘醇5m L，1mol/L NaOH 溶液 0.5m L，搖勻，在 40℃ 保溫10m in，倒入厚度為1cm的比色皿中，空白以蒸餾水代替NaOH，在最適波長下測定光密度。柚苷酶活力的定義為:在40℃，pH3.8條件下，每毫升柚皮苷酶每分鐘催化分解1μg柚皮苷為一個單位，以 U/m L表示。

1.2.3 柚皮苷酶的熱穩定性 配制0.1mg/m L的柚皮苷酶溶液，分別在30～80℃下保溫，每隔30m in取0.1m L酶液測定殘留酶活，總處理時間為150min，本文中殘留酶活都用相對酶活表示，定義未經任何處理的柚皮苷酶活力為100%。

1.2.4 超聲波對柚皮苷酶活性的影響 取25m L 0.1mg/m L的柚皮苷酶溶液于50m L燒杯中，將超聲波變幅桿插入處理液下10～15cm。頻率固定為20kHz，脈沖方式為 1∶1，分別在功率為 40、80、120、160、200、280W 下處理 5～40min，測定柚皮苷酶殘存酶活，以相對酶活表示。

1.2.5 超聲波對柚皮苷酶熱穩定性的影響 將80W及280W超聲波處理后的柚皮苷酶溶液置于60℃下保溫不同時間(0～150m in)，每隔30min取0.1m L酶液測定殘留酶活。在給定條件下，保留的活性越高，酶的穩定性越強。

1.2.6 熱處理及超聲波處理對柚皮苷酶二級結構的影響 二級結構可以用遠紫外圓二色譜測定［5－6］，為適合圓二色譜分析，配制蛋白質含量為0.15mg/m L的柚皮苷酶溶液。

用Blo－Logic MOS－450圓二色譜儀測定熱處理及超聲波處理前后柚皮苷酶遠紫外圓二色譜變化。樣品池光程為0.1cm，在25℃和連續充氮的條件下，進行遠紫外區域(185～250nm)掃描，速度為3.3nm/s，光譜間隔0.5nm，3次累積。克分子橢圓率［θ］=θ/(10CL)，式中，θ:CD儀測出的橢圓率單位(mdeg);C:柚皮苷酶濃度(mg/m L);L:比色皿的厚度(cm)。通過儀器提供的軟件 CDPro－Protein Secondary Structure Estimation Program，套用43種不同的蛋白模型，采用Continll算法估算原酶液及不同處理的柚皮苷酶溶液二級結構中α螺旋、β折疊、β轉角和無規則卷曲所占的比率。

2 結果與分析

2.1 柚皮苷酶的熱穩定性

圖1所示為柚皮苷酶在不同溫度下的失活動力學曲線，由于柚皮苷酶是一種混合酶，因此酶的熱失活并不遵循一級動力學曲線［7］。從圖1中可知，柚皮苷酶在30℃下保溫90m in，酶活幾乎沒有損失，保溫150min，酶活仍然高達85.3%。當溫度為40℃時，柚皮苷酶開始發生變性，酶活下降比較顯著。隨著溫度的升高，酶變性速度加快，酶活下降的速度也隨之增大。當溫度高于70℃時，酶失活速度顯著增大，在70℃和80℃柚皮苷酶的半衰期分別在100m in和50m in左右。在80℃下保溫150m in，柚皮苷酶殘留酶活僅為15.69%。這是因為在任何溫度下，總會有少量酶分子處于較高能量狀態，這些分子會越過能障成為非活性分子，導致酶活降低。相對來說，柚皮苷酶是一種比較耐熱的酶。

2.2 超聲波處理對柚皮苷酶穩定性的影響

大多數研究表明，超聲功率不同，對酶的處理效果也不同。較低強度的超聲作用，超聲強度與酶活力呈正相關，隨著強度的增大，酶逐漸被激活，強度越高，酶的催化活力越高。若進一步加大強度，酶催化活力反而降低［8－9］。

圖2所示為柚皮苷酶在不同超聲功率下作用不同時間酶活性的變化，從圖2中可知，超聲波對柚皮苷酶的活性影響隨著功率和處理時間均有所變化，當超聲功率在40～120W時，柚皮苷酶活性隨超聲時間的延長先升高后降低，40W處理5min、80W處理10m in，柚皮苷酶活性分別比原酶增加 5.77%和9.54%;120W 超聲 30min，相對酶活仍然高達106.65%，隨后酶活急劇下降，在超聲40m in時酶活降為原酶的81.26%。隨著超聲功率的增大，超聲時間的延長，柚皮苷酶活性呈下降趨勢，當柚皮苷酶在280W下處理40min，酶活損失高達37.27%。因此，超聲功率為40～120W之間時，短時間的超聲處理對柚皮苷酶活性有促進作用，當處理達到一定時間后，酶活性逐漸下降［8－10］;當功率大于 160W 時，超聲波對柚皮苷酶活性有鈍化作用。這是因為酶是一種活性生物分子，其活性的高低從根本上取決于酶分子構象的合理程度。較低強度的超聲處理可導致酶分子能量的增加與介質溫度的增高，引起酶分子構象的微小變化，使酶分子的超微結構更具有柔性、更合理，從而表現出較高的催化活性;但在較高強度的超聲作用下，酶分子的能量進一步加大，構象進一步改變，趨向于不合理的構象，導致酶分子本身的催化活力受到阻礙，表現為酶的失活［11］。

圖2 超聲波處理對柚皮苷酶穩定性的影響

2.3 超聲波對柚皮苷酶熱穩定性的影響圖3為柚皮苷酶經過超聲波處理后，在60℃保溫不同時間活性的變化情況。從圖3可知，超聲波功率和超聲時間對柚皮苷酶的熱穩定性影響較大。

與未經超聲處理的柚皮苷酶相比，80W處理對柚皮苷酶的熱穩定性有促進作用，即柚皮苷酶的半衰期延長;80W處理5m in后，60℃保溫150m in，酶活性比未經處理的柚皮苷酶活性增加了64.34%。當超聲處理的功率為280W，超聲時間超過5m in時，柚皮苷酶的熱穩定受到抑制;280W處理40min后，60℃保溫150m in，酶活性比未經處理的柚皮苷酶活性降低了42.61%。對比圖3(a)和圖3(b)可得知，80W處理的柚皮苷酶半衰期明顯比280W處理的柚皮苷酶半衰期長。這與柚皮苷酶二級結構的變化密切相關，從表1中可知，80W處理后β－折疊含量下降，而無規則卷曲含量上升，表明柚皮苷酶的結構變得更具有柔性、更加合理，底物分子更容易進入酶活性中心，因此柚皮苷酶活性得到提高;280W處理后β－折疊含量上升，而β－轉角和無規則卷曲含量均有所下降，表明柚皮苷酶的結構變得更具有剛性，結構更加緊密，底物分子較難進入酶活性中心，因此柚皮苷酶活性也相對降低。

2.4 不同處理對柚皮苷酶二級結構的影響

圖3 超聲波功率80W及280W處理對柚皮苷酶熱穩定性的影響

從表1可知，柚皮苷酶中α－螺旋含量較少，主要結構為β－折疊和無規則卷曲。熱處理的溫度高低對柚皮苷酶的二級結構影響不同，40℃處理60m in，α－螺旋和β－折疊含量均降低，β－轉角含量上升;60℃處理60m in，無規則卷曲含量降低1.5%，β－折疊含量增加1.1%。說明柚皮苷酶分子在低溫處理時柔性增大，結構變得更加松散，同時β－轉角增多，酶活性中心或者鍵合位點被覆蓋的幾率增大，導致底物和酶結合失敗的概率增大，從而使酶失去活性;而在較高溫度處理時剛性增大，同時β－折疊非自然的錯誤增多，最終導致酶天然構象改變，活性中心或鍵合位點就越少，酶活性越差［12－13］。超聲波功率高低對柚皮苷酶的二級結構也有類似影響，較低功率時β－折疊和β－轉角含量均降低，無規則卷曲含量上升0.9%，而在較大功率時，二級結構的變化主要為β－折疊和無規則卷曲含量的變化。

表1 熱處理及超聲波處理對柚皮苷酶二級結構的影響

圖4所示為柚皮苷酶在熱處理及超聲波處理前后圓二色譜的變化。從圖4中可知，未經處理的柚皮苷酶在208nm及222nm有兩個負峰，［θ］208=－539deg·cm2·dmol－1，這是 α－螺旋的典型結構，但是雙負峰并不十分明顯，可以判斷柚皮苷酶中螺旋結構比例很少，熱處理和超聲處理后，負峰位置并沒有發生明顯變化，可知α－螺旋結構并沒有受到影響，這與表1中數據相吻合。圖4中顯示在200nm及215nm附近均有明顯的負峰，這是β－折疊的典型結構，相比于未處理的柚皮苷酶，圖4(a)中200nm附近的負峰在40℃處理后往下移，說明β－折疊結構含量降低，而60℃處理后的柚皮苷酶在215nm處的負峰往上移，說明β－折疊結構含量增加。圖4(b)中超聲波處理的柚皮苷酶相應位置的負峰也有類似變化。圖中205nm及218nm處均有一個明顯正峰，這分別是β－轉角和無規則卷曲的典型結構，與未經處理的柚皮苷酶相比，熱處理和80W及160W超聲波處理后205nm處的正峰均明顯下移，而280W超聲處理正峰位置幾乎沒有變化，說明熱處理及低功率的超聲處理對柚皮苷酶的β－轉角結構有顯著影響。40℃處理60m in后柚皮苷酶218nm處的正峰發生藍移，而60℃處理正峰峰形及位置都沒明顯變化，不同功率超聲處理后218nm處的正峰位置均有所下降，80W時變化最為明顯，說明較低溫度及較小超聲功率對柚皮苷酶的無規則卷曲結構影響較大。因此，溫度及超聲波均能導致柚皮苷酶的構象變化。

圖4 熱處理及超聲波處理對柚皮苷酶圓二色譜的影響

圖4中所示的圓二色譜圖與典型的α－螺旋雙負峰圖譜有所差異，可能原因有:柚皮苷酶純度可能不高或者在使用過程中混入了其它干擾雜質;柚皮苷酶是由α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶組成的混合酶系，并不是單一酶種，因此兩種酶在遠紫外區的吸收可能會相互干擾;柚皮苷酶在儲藏過程中，構象可能發生了不可逆的變化。因此，如何從柚皮苷酶中分離純化α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶，以及這兩種酶的二級結構在超聲波及熱處理后的變化將是后續研究的重點。

3 結論

柚皮苷酶隨著溫度的升高，酶失活速率加快，在80℃下保溫150m in，柚皮苷酶殘留酶活僅為原酶的15.69%;超聲功率為40～120W時，短時間的超聲處理對柚皮苷酶活性有促進作用，功率大于160W時超聲波處理對柚皮苷酶活性有鈍化作用。80W處理對柚皮苷酶的熱穩定性有促進作用，處理5m in后60℃保溫150m in，酶活性比未經處理的柚皮苷酶活性增加了64.34%;而280W處理對柚皮苷酶的熱穩定有鈍化作用，處理40m in后60℃保溫150m in，酶活性比未經處理的柚皮苷酶活性降低了42.61%。圓二色譜結果顯示，未經處理的柚皮苷酶中α－螺旋結構含量較少，主要結構為β－折疊和無規則卷曲，熱處理及超聲波處理對柚皮苷酶β－螺旋幾乎沒有影響，β－折疊、β－轉角及無規則卷曲含量的變化分別在0.4%～1.1%、0.1%～0.4%及0～0.9%之間。

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Effect of ultrasonic and heat treatment on the activity and secondary structure of naringinase

ZENG Lin－lin，HUANG Hui－hua*

(College of Light Industry and Food Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

The effects of ultrasonic and heat treatment on the activity and secondary structure of naringinase were studied.The results showed that the activity of naringinase was found decreased to 15.69%with heat treatment for 150m in at80℃.Naringinase activity was found enhanced with ultrasonic treatment for a short time from 40W to 120W，but inhibited once the ultrasonic power higher than 160W.The thermostability of naringinase was promoted under 80W ultrasonic treatment，but passivated under 280W.Naringinase activity was increased by 64.34%under 80W，5m in ultrasonic treatment，while decreased by 42.61%under 280W，40m in ultrasonic treatment.CD detection showed that the content ofα－helix remained steady under heat and ultrasonic treatment，while the content changes ofβ－sheet，β－turn and random were found from 0.4%～1.1%，0.1%～0.4%and 0～0.9%，respectively.

naringinase;ultrasonic;heat treatment;circular dichroism;secondary structure

TS255.1

A

1002－0306(2011)08－0101－04

2010－06－28 *通訊聯系人

曾霖霖(1987－)，男，在讀碩士，研究方向:食品科學。

國家星火計劃項目(2007EA780005);廣東省關鍵領域重點突破項目(2008A024200003)。