面包酵母海藻糖含量與酵母耐性之間的關系

陳麗君，肖冬光，郭學武，張翠英，蓋偉東

(工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

面包酵母海藻糖含量與酵母耐性之間的關系

陳麗君，肖冬光*，郭學武，張翠英，蓋偉東

(工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

以存活率為指標，探討了不同時期不同面包酵母的耐鹽性能、耐酒精性能、耐高溫性能以及耐冷凍性能，并且測定了不同時期菌體胞內海藻糖含量，研究結果表明胞內海藻糖含量與酵母的耐受性之間存在一定的相關性，海藻糖含量越高，酵母的耐性越好。

面包酵母，海藻糖，耐性，耐凍性，存活率

面包酵母在微生物分類學上屬于酵母屬、釀酒酵母種(Saccharomyces cerevisiae)，是面包生產過程中最重要的微生物發酵劑和生物疏松劑，在面包生產中起著關鍵作用［1］。酵母耐性一般是指耐酒精性、耐高溫性、耐鹽性以及耐冷凍性，它已成為工業生產、育種等方面的一個重要指標。海藻糖是生物體內的一種典型的應激代謝物，被人稱為“生命之糖”，研究表明酵母耐性與菌體胞內海藻糖含量存在著一定的關系［2－6］。許多生物在脅迫環境(如高溫、冷凍、高滲等)下表現出的抗逆耐受力與體內的海藻糖含量有直接的關系，生物體可以通過促進海藻糖的合成來抵御外界的不良傷害，所以胞內海藻糖含量被認為是酵母耐性的重要鑒定指標［7－9］。但是胞內海藻糖含量與酵母耐性之間存在一種怎樣的關系還并沒有統一的定論，因此酵母耐性與海藻糖含量之間的關系有待于進一步研究。本工作首先確定了酵母存活率的測定方法，在此基礎上測定了不同時期、不同面包酵母菌株的耐性和菌體胞內海藻糖含量，探討了酵母耐性與胞內海藻糖含量之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

面包酵母菌株 實驗室保存，標號分別為BY－6、BY－12、BY－14、A6、B6、BY－24;YEPD 培養基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH5.0，121℃滅菌15m in;耐鹽培養基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，NaCl 5%，121℃滅菌15m in;耐酒精培養基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，121℃滅菌15m in，待冷卻至室溫，加入15%Vol的無水乙醇。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮酵母的制備 在30℃下，經種子培養基靜置培養24h后，以10%接種量轉入YEPD培養基中培養至穩定期，菌體經離心洗滌2次后收集備用。

1.2.2 細胞存活率方法的確定 取培養至對數期的菌液5m L，用無菌水離心洗滌3次后，將菌體轉接于含有15%Vol酒精的YEPD培養基中，30℃、160r/min處理1h，以存活率為指標，采用亞甲基藍染色法以及活菌計數法對菌株對數期的耐酒精性能進行測定。

1.2.3 酵母耐性實驗 耐鹽性實驗:取培養到對數期(穩定期)的菌液5m L，用無菌水離心洗滌3次后，轉接于含有 5%NaCl的 YEPD培養基中，30℃、160 r/m in處理1h，測定處理前后活菌數，計算菌體存活率。

表1 亞甲基藍染色法測定酵母存活率

表2 活菌計數法測定酵母存活率

表3 酵母耐受性與菌體胞內海藻糖含量的關系

耐酒精實驗:取培養到對數期(穩定期)的菌液5m L，用無菌水離心洗滌3次后，轉接于含有15%Vol酒精的YEPD培養基中，30℃、160 r/m in處理1h，測定處理前后活菌數，計算菌體存活率。

耐高溫實驗:取培養到對數中期(穩定期)的菌液1m L，用無菌水離心洗滌3次后，懸浮于9m L生理鹽水中，在52℃水浴鍋中處理30m in，迅速冷卻至室溫，測定處理前后活菌數，計算菌體存活率。

耐冷凍實驗:取培養到對數中期(穩定期)的菌液1m L，用無菌水離心洗滌3次后，收集菌體，放入－20℃冰箱中冷凍保存21d后，30℃解凍30min，測定冷凍前后的活菌數，計算冷凍存活率。

1.2.4 酵母胞內海藻糖含量的測定 硫酸蒽酮法，參考文獻［10］。

2 結果與討論

2.1 酵母存活率測定方法的確定

選用BY－6為測試菌株，取7個平行樣，以存活率為指標，采用染色法以及活菌計數法分別對對數期菌體的耐酒精性能進行測定，結果見表1與表2。

由表1和表2可以看出，由染色法測定的酵母存活率上下偏差起伏較大，標準偏差為3.18，而活菌計數法測定的存活率數據較為一致，計算的標準偏差為0.61。由此可見，采用染色法測定的酵母細胞存活率比采用活菌計數法所測定的存活率誤差大很多，可能的原因是因為染色劑與放置溫度有一定的關系，另外有些細胞呈現淺藍色，不能準確判定細胞是否死亡，所以在計數時存在很大的誤差，因此在本實驗中存活率的測定方法選用活菌計數法。

2.2 酵母耐性與海藻糖含量的關系

以存活率為指標，測定6株面包酵母菌株對數期和穩定期的耐受性，同時測定了6株菌株兩個時期的胞內海藻糖含量，測定結果見表3。

由表3可知，6株不同的面包酵母菌株胞內海藻糖含量在穩定期普遍高于對數生長期。在對數期時，6株菌株胞內海藻糖含量都比較低，其中BY－24胞內海藻糖含量最高，但也只達到3.12%，A6胞內海藻糖含量最低，只有0.98%;進入穩定期后，6株菌株胞內海藻糖含量大大提高，含量基本都在10%以上，其中仍是 BY－24胞內海藻糖含量最高，高達17.62%，比對數期提高了5.6倍，BY－6菌株海藻糖含量最低，為9.44%，但也比對數期胞內海藻糖含量提高了9.5倍。由此可見，穩定時期菌體胞內可以大量積累海藻糖，這是因為海藻糖屬于生物體內一種典型的應激代謝物，當細胞處于穩定期時，胞內開始產生代謝產物，因而此時酵母細胞內開始有大量海藻糖的積累。

從表3還可以看出，不同時期、不同面包酵母的耐性存活率也有很大差異，其中處于穩定期的酵母菌體耐性存活率比對數期菌體耐性存活率高很多。出現這一現象的原因可能是因為處于對數期的菌體生長旺盛，細胞生長易受外界環境條件的影響，細胞死亡呈現很大的隨機性，因而測得的細胞存活率很低，并且極不穩定。

2.3 酵母耐性與胞內海藻糖含量相關性分析

在測定的6株面包酵母中，處于同一時期不同的面包酵母，BY－24胞內海藻糖含量最高，其各種耐性存活率最高;穩定期6株菌體各種耐性存活率趨勢為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，菌體胞內海藻糖含量趨勢為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，二者之間的關系見圖1～圖4。由圖1～圖4可以看出，菌體的耐性存活率與胞內海藻糖含量二者之間存在一定的相關性(R2＞0.85)，菌體胞內海藻糖含量越高，其耐性存活率也越高，由此可以說明，海藻糖含量的積累有助于菌體耐性存活率的提高。

圖1 菌體耐酒精性能與胞內海藻糖含量之間的關系

圖2 菌體耐鹽性能與胞內海藻糖含量之間的關系

圖3 菌體耐高溫性能與胞內海藻糖含量之間的關系

圖4 菌體耐冷凍性能與胞內海藻糖含量之間的關系

3 討論

通過對6株面包酵母菌株不同時期的耐性存活率進行測定，結果表明不同的酵母菌株處于穩定期的各種耐性存活率普遍高于對數期的菌體存活率，因而說明穩定期酵母菌體耐性要比對數期菌體耐性好，在穩定期可以獲得大量菌體，有相關研究也說明了這一點［12－13］。

國內外研究表明，菌體胞內海藻糖含量與菌體耐受性之間存在一定的相關性［2－6］。Sukesh［2］對酵母細胞在加鹽培養基中的生長情況進行了報道，發現海藻糖含量與細胞對外界不利環境的耐受性有著密切關系。史戈峰［3］和高峻［4］等發現酵母胞內海藻糖的累積與良好的酒精發酵性能、較高的細胞存活率相關聯，證明了海藻糖積累較多時對酵母細胞有一定的保護作用。Diniz－Mendes等［5］研究發現細胞經預先短時溫和熱處理，可增加細胞內海藻糖的積累，可以提高酵母細胞的存活率。Hino等［6］研究發現胞內海藻糖的累積與較高的冷凍存活率有著密切的關系。本文對6株面包酵母菌株穩定期的海藻糖含量測定的結果為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，各種耐性存活率均為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，由此可以看出胞內海藻糖含量的提高可以大大提高菌體的耐受能力，可能是因為處于穩定時期的菌體胞內會大量積累海藻糖，它賦予生物體抵抗干燥、干旱、寒冷、高溫以及氧自由基等惡劣環境的能力。

到目前為止，國內外針對于酵母幾種耐性與海藻糖含量的關系還沒有綜合性的研究，本文對酵母的耐凍性能、耐鹽性能、耐酒精性能以及耐高溫性能與菌體胞內海藻糖含量之間的關系進行了簡單的探討，有關酵母耐性與胞內海藻糖含量的關系還需進一步研究。這一問題的解決將會為耐性面包酵母菌的選育開辟一條新的途徑，不僅可以提高我國焙烤食品行業的技術水平，同時對酵母行業的發展也有重要意義。

［1］馮薇，段緒果 .面包酵母研究進展［J］.化工時刊，2008，22(7):42－45.

［2］Sharma SC.A possible role of trehalose in osmotolerance and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae［J］.FEMS Microbiology Letters，1997，152(1):11－15.

［3］史戈峰，莫湘藥.酵母酒精發酵性能及海藻糖代謝［J］.無錫輕工大學學報，1999，18(5):122－125.

［4］高峻，池振明.耐高濃度酒精酵母菌與酒精敏感酵母菌中海藻糖含量與耐酒精的關系［J］.食品與發酵工業，2001，27(5):4－7.

［5］Diniz－Mendes L，Bernardes E，de Araujo PS，et al.Preservation of frozen yeast cells by trehalose［J］.Biotechnology and Bioengineering，1999，65(5):572－578.

［6］Hino A，Mihara K，Nakashima K，et al.Trehalose levels and survival ratio of freeze－tolerant versus freeze－sensitive yeasts［J］.Applied and Environmental Micribiology，1990，56(5):1386－1391.

［7］呂燁，肖冬光，和東芹，等.酵母海藻糖酶缺失突變株的構建及其耐性［J］.微生物學報，2008，48(10):1301－1307.

［8］呂瑩果，王群學，陳能飛.胞內海藻糖含量對冷凍面團中酵母抗凍性的影響［J］.四川食品與發酵，2007，43(1):1－7.

［9］張玉華，凌沛學，籍保平.海藻糖的研究現狀及其應用前景［J］.食品與藥品 A，2005，7(3):8－13.

［10］Ferreira JC，Paschoalin VMF，Panek AD，et al.Comparison of three different methods for trehalose determination in yeast extracts［J］.Food Chemistry，1997，60(2):251－254.

［11］細胞培養的相關操作http://blog.sina.com.cn/nnpp87.

［12］Hounsa CG，Brandt EV，Thevelein J，et al.Role of trehalose in survival of S.cerevisiae under osmotic stress［J］.Microbiology，1998，144:671－680.

［13］DE Virgilio C，De Virgilio C，Hottiger T，et al.The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast.I.Genetic evidence that trehalose is a thermoprotectant［J］.European Journal of Biochemistry，1994，219:179－186.

Correlation between the trehalose content and the stress resistance of the baker yeasts

CHEN Li－jun，XIAO Dong－guang*，GUO Xue－wu，ZHANG Cui－ying，GAI Wei－dong

(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

The freeze－tolerance，the stress resistance and the trehalose content of different baker yeasts in the different periods was discussed.It was found that there was a correlation between the trehalose content and the stress resistance，and there was a better stress resistance with the higher trehalose content.

baker yeast;trehalose;stress resistance;freeze－tolerance;survival rate

TS201.2

A

1002－0306(2011)08－0112－04

2010－07－19 *通訊聯系人

陳麗君(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:現代釀造技術。

國家科技支撐計劃項目(2007BAK36B04);天津市科委自然基金重點項目(10JCZDJC16700)。