氧載體在黃原膠發酵中的應用

林 琳，鄧 春，龍 柯，程 蓉，張永奎

(四川大學化工學院制藥與生物工程系，四川成都 610065)

氧載體在黃原膠發酵中的應用

林 琳，鄧 春，龍 柯，程 蓉，張永奎*

(四川大學化工學院制藥與生物工程系，四川成都 610065)

黃原膠發酵過程中因發酵液粘度逐漸增加，系統供氧不足，導致黃原膠產率受到影響。為改善發酵系統供氧情況，提高黃原膠產率，本實驗研究添加氧載體(大豆油、正己烷、正十二烷)對黃原膠發酵的影響。實驗結果表明:發酵初期添加6%(v/v)大豆油、發酵12h添加1%(v/v)正己烷，發酵72h，可分別顯著提高黃原膠產率至2.347%和2.927%，相對于空白組分別提高18%和47%;另外，實驗發現:大豆油組細胞干重有明顯提高，發酵72h后，仍能觀察到部分形態正常的細胞，延長發酵周期至84h，黃原膠產率顯著提高至2.977%，相對于空白組提高49%;正己烷組發酵72h，多數細胞自溶，延長發酵周期不能進一步提高黃原膠產率，但加入正己烷使供氧情況得到改善，正己烷組細胞莢膜(即黃原膠)明顯厚于空白組。

黃原膠，發酵，氧載體，正己烷，大豆油

黃原膠是由野油菜黃單胞菌發酵生產的酸性胞外多糖，是一種重要的工業生物高分子聚合物。黃原膠具有優越的假塑性、觸變性和增粘性等，在食品、采油、化妝品等工業中得到廣泛應用［1－2］。野油菜黃單胞菌是好氧菌，在發酵生產過程中，隨著粘度增大，物料混合以及氧分散能力大大下降，造成供氧不足，導致黃原膠產率難以提高。因此，溶氧濃度是整個發酵過程的重要限制因素。氧載體一般指不溶于培養基但能夠吸附或包裹氧的物質，通過在發酵液中引入一種新液相(與發酵液互不相溶)，以減少氣液傳氧阻力，提高氧氣傳質速率，這種液相一般具有比水更高的溶氧能力［3］。發酵系統中加入氧載體，可增強系統供氧能力，提高黃原膠產率，且無需額外提供能量［4－5］。大豆油［6－7］及碳氫化合物［8－9］常用作好氧發酵系統的氧載體，國內雖有在黃原膠發酵系統中分別添加正己烷［10］和正十二烷［5］作為氧載體的報道，但未對各種氧載體進行系統比較研究，且不夠深入。本實驗以提高黃原膠產率為目的，考察常見的幾種氧載體(大豆油、正己烷、正十二烷)對黃原膠發酵體系的影響，為工業化生產提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究所用菌種 本實驗室保藏的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris);固體培養基(g/L) 蔗糖20、蛋白胨5、牛肉膏3、酵母膏1、瓊脂20，pH7.0;種子培養基(g/L) 蔗糖20、蛋白胨5、牛肉膏3、酵母膏1，pH7.0;發酵培養基(g/L) 蔗糖50、蛋白胨6、K2HPO45.0、MgSO4·7H2O 0.3、CaCO33.0、檸檬酸1，pH7.0;大豆油 上海嘉里公司;正己烷、正十二烷

成都科龍公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞干重測定 移取發酵液1m L，適當稀釋，離心(10000 r/m in，15m in)，洗滌三次，60℃烘干至恒重，稱重。

1.2.2 黃原膠提取與含量測定 添加上清液質量0.2%的氯化鉀，再添加3倍體積的無水乙醇，攪拌產

1.2.3 細胞形態的觀察 野油菜黃單胞菌經莢膜染色法染色［11］，顯微鏡觀察。

1.2.4 發酵培養條件 接種經平板活化后的單菌落于種子培養基，裝液量 50m L/250m L，搖床培養(30℃，180 r/m in)28h;再以10%接種量接種于發酵培養基，裝液量20m L/100m L，在發酵的不同時期加入不同濃度的大豆油、正己烷、正十二烷，搖床發酵(30℃，180 r/m in)，提取黃原膠，計算產率。生黃原膠絮狀沉淀，過濾收集黃原膠沉淀。所得黃原膠60℃烘干至恒重，稱重，黃原膠產率按式(1)計算:

2 結果與討論

2.1 氧載體加入量對黃原膠發酵的影響

發酵初期分別以2%、4%、6%、8%、10%和12%(v/v)加入量，添加大豆油、正己烷、正十二烷，搖床發酵(180 r/m in，30℃)72h，結果如圖1。隨著大豆油加入量的增加，黃原膠產率提高，當添加6%(v/v)大豆油時，產率為2.347%，相對于空白組提高18%。然而，隨著加入量進一步增大，黃原膠產率呈明顯下降趨勢，過量加入大豆油導致發酵液水分流失，且表觀粘度增大造成氧氣傳質系數降低［12］。添加2%(v/v)以上的正己烷或正十二烷均使黃原膠產率下降，這可能是由于正己烷和正十二烷加入量過高，對發酵產生抑制作用。降低正己烷和正十二烷加入量，結果如圖2。正己烷加入量降低后，黃原膠產率顯著提高，當添加 1%(v/v)正己烷時，產率為2.413%，相對于空白組提高21%。但僅添加0.25%(v/v)正十二烷，黃原膠產率仍未提高且呈下降趨勢，正十二烷可能對黃原膠生物合成相關的某些酶系有不利影響，因此正十二烷不適合作為氧載體用于本系統中。

圖1 不同濃度氧載體(大豆油、正己烷、正十二烷)對黃原膠發酵的影響

圖2 降低正己烷、正十二烷加入量對黃原膠發酵的影響

2.2 氧載體加入時間對黃原膠發酵的影響

分別于發酵 0、12、24、36、48、60h，向發酵系統中添加6%(v/v)大豆油或1%(v/v)正己烷，搖床發酵(180 r/m in，30℃)72h，結果如圖3。隨著大豆油加入時間的推后，黃原膠產率逐漸下降，而發酵12h添加正己烷，產率為2.927%，相對于空白組提高47%。一般而言，有機溶劑的Log P(在標準狀態下，溶劑在辛醇和水兩相系統中分配系數的對數值)大于4表明其具有良好的生物相容性，對微生物細胞沒有毒害作用［13］。而正己烷Log P為3.5，故在細胞適應環境(發酵12h)后添加正己烷，能削弱其對細胞的毒害作用。

圖3 氧載體加入時間對黃原膠產率的影響

發酵過程中生物量隨時間的變化如圖4所示。可以看出，大豆油組最高細胞濃度為10.933g/L，遠高于空白組最高細胞濃度6.233g/L，說明發酵初期添加6%(v/v)大豆油有利于改善供氧，對細胞生長有明顯促進作用。發酵12h添加1%(v/v)正己烷獲得的細胞濃度與空白組相差不大，而發酵初期添加1%(v/v)正己烷，細胞濃度降低，這進一步驗證了發酵初期加入正己烷對細胞的毒害作用。

圖4 氧載體加入對黃單胞菌生長的影響

2.3 發酵過程中細胞形態的變化

在黃原膠發酵的不同時期，取空白組、大豆油組(發酵初期加入6%(v/v)大豆油)及正己烷組(發酵12h加入1%(v/v)正己烷)發酵液，進行細胞莢膜染色，用油鏡觀察細胞形態，結果如圖5。發酵初期，細胞外層幾乎沒有胞外多糖，即黃原膠;發酵24h，空白組和兩個實驗組中均可觀察到有一層較薄的莢膜，說明發酵前期主要是細胞生長，而黃原膠還未大量生成;發酵48h，三組細胞外層莢膜顯著變厚，部分細胞出現自溶，細胞自溶釋放的胞內酶雖對黃原膠合成有利，但細胞自溶標志著發酵即將結束，因此黃單胞菌的莢膜厚度在細胞自溶后達到最大;發酵72h，空白組和正己烷組中多數細胞自溶，因加入正己烷改善發酵供氧情況，正己烷組的細胞莢膜明顯厚于空白組，大豆油組中雖有細胞自溶，但仍可觀察到部分形態正常的細胞，說明發酵還可繼續。為此，分別延長大豆油組和正己烷組的發酵周期，結果如圖6。延長大豆油組發酵周期至84h，產膠率顯著提高至2.977%，相對于空白組提高49%，說明大豆油組更高的產膠率可通過延長發酵周期獲得。延長正己烷組發酵周期不能進一步提高黃原膠產率。

圖5 發酵過程中空白組(a)、大豆油組(b)、正己烷組(c)細胞形態的變化

圖6 延長發酵周期對黃原膠產率的影響

3 結論

3.1 大豆油、正己烷可作為黃原膠發酵系統的有效氧載體，發酵初期加入6%(v/v)大豆油、發酵12h加入1%(v/v)正己烷，產膠率分別為2.347%和2.927%，相對于空白組分別提高18%和47%。

3.2 加入量0.25%～12%(v/v)范圍內的正十二烷不能提高黃原膠產率，對黃原膠發酵有抑制作用，因此正十二烷不適合作為氧載體用于本系統中。

3.3 發酵初期加入6%(v/v)大豆油，對細胞生長有明顯的促進作用，最大細胞濃度為10.933g/L，并使細胞自溶滯后，因此延長發酵周期至84h，產膠率顯著提高至2.977%，相對于空白組提高49%。發酵12h加入1%(v/v)正己烷對細胞生長沒有促進作用，也不能使細胞自溶滯后，但加入正己烷改善發酵供氧情況，使得細胞莢膜明顯厚于空白組。

［1］Rosalam S，England R.Review of xanthan gum production from unmodified starches by Xanthomonas comprestris sp.［J］.Enzyme Microb Technol，2006，39:197－207.

［2］Garcia－Ochoa F，Santos V E，Casas JA，et al.Xanthan gum:production，recovery，and properties［J］.Biotechnol Adv，2000，18:549－579.

［3］歐杰，李柏林，程抒劼.混合烷烴對野油菜黃單胞菌合成黃原膠的影響［J］.食品科學，2007，28(8):273－276.

［4］Jia S，Wang M，Kahar P，et al.Enhancement of yeast fermentation by addition of oxygen vectors in air－lift bioreactor［J］.J Ferment Bioeng，1997，84(2):176－178.

［5］歐杰，劉秀杰，阮塑瑜.攜氧劑(正十二烷)對黃原膠發酵的影響［J］.食品科技，2006，31(9):174－176.

［6］梁新樂，勵建榮，陳敏，等.氧載體強化氧傳遞促進法夫酵母蝦青素的合成［J］.菌物系統，2003，22(3):424－429.

［7］Jia S，Chen G，Kahar P，et al.Effect of soybean oil on oxygen transfer in the production of tetracycline with an airlift bioreactor［J］.J Biosci Bioeng，1999，87(6):825－827.

［8］劉元帥，石國領，吳建勇.添加液態烷烴氧載體對法夫酵母發酵生產蝦青素的影響［J］.食品與發酵工程，2005，31(6):43－46.

［9］Zhang J，Wang X，Zhang J，et al.Oxygen vectors used for S－adenosyl methionine production in re－combinant pichia pastoris with sorbitol as supplemental carbon source［J］.JBiosci Bioeng，2008，105(4):335－340.

［10］楊秋艷，程蓉，汪智姝，等.氧載體(正己烷)對黃原膠發酵的影響［J］.食品科技，2009，34(4):218－221.

［11］沈萍，范秀容，李光武.微生物學實驗［M］.北京:高等教育出版社，2004:34－35.

［12］梁心樂，勵建榮，陳敏，等.氧載體強化氧傳遞促進法夫酵母蝦青素的合成［J］.菌物系統，2003，22(3):424－429.

［13］Colja L，Sjef B，Kees V，et al.Rulse for optimization of biocatalysis in organic solvents［J］.Biotechnol Bioeng，1987，30(1):81－87.

Application of oxygen vectors in xanthan gum production

LIN Lin，DENG Chun，LONG Ke，CHENG Rong，ZHANG Yong－kui*

(School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

In xanthan gum fermentation process，the level of dissolved oxygen drops with the viscosity increasing，and the synthesis of xanthan gum is inhibited.Adding oxygen vectors to the system of xanthan gum fermentation is a method to imp rove oxygen supply.The optimalsoybean oilconcentration and adding time was 6%(v/v)and 0h，and the optimal n－hexane concentration and adding time was 1%(v/v)and 12h.The addition of soybean oil and n－hexane significantly improved xanthan gum yield to 2.977%and 2.927%，respectively(increased by 49%and 47%，respectively).Although partial autolysis occurred in the soybean oil group，synthesis could still continue in most normal cells by 72h，which made it possible to extend fermentation period.Prolonging fermentation with n－hexane had little effect on the yield，however the capsule around the cell was obviously much thicker than that of control group after 72h fermentation.

xanthan gum;fermentation;oxygen vector;n－hexane;soybean oil

TS201.3

A

1002－0306(2011)08－0192－03

2010－07－16 *通訊聯系人

林琳(1986－)，女，碩士研究生，主要從事微生物發酵方面研究。