DNA染料結合環介導等溫擴增技術檢測志賀氏菌死活細胞

李 月，王 麗，孫遠明，鐘青萍

(華南農業大學食品學院，廣東廣州 510640)

DNA染料結合環介導等溫擴增技術檢測志賀氏菌死活細胞

李 月，王 麗，孫遠明，鐘青萍*

(華南農業大學食品學院，廣東廣州 510640)

建立了一種DNA染料(EMA)結合環介導等溫擴增技術(Loop－mediated isothermal amplification，LAMP)的分析方法(EMA－LAMP)，用于有效檢測區分病原微生物志賀氏菌的死活細胞?；谥举R氏菌ipaH基因的六個區域設計特異性的引物，檢測志賀氏菌的死活細胞。結果表明:濃度為40μg/mL的EMA能夠有效抑制109CFU/mL的死細胞擴增，而對相同濃度的活菌擴增沒有影響。分析表明，該方法可以有效區分細菌的死活細胞，克服了傳統PCR無法區分死活細胞的弊端，同時EMA－LAMP檢測方法耗時短，檢測靈敏度高，是一種能夠有效鑒別病原菌死活細胞的新方法。

ethidium monoazide，環介導等溫擴增技術(LAMP)，Shigella，死活細胞

志賀氏菌(Shigella)是引起細菌性痢疾最為常見的致病菌，食源性志賀氏菌中毒的最主要原因是從事食品加工行業的人員患痢疾或帶菌者污染食品，食品接觸人員個人衛生差，存放已污染的食品，儲存條件不當等［1］。志賀氏菌屬在我國感染性腹瀉病原菌中居首位，人類對志賀氏菌有很高的易感性，103～104CFU/m L細菌可致病，在幼兒中可引起急性中毒性菌痢，死亡率很高［2］。目前國內外對于志賀氏菌的檢測方法主要采用傳統的分離鑒定方法，分子生物學方法如PCR以及免疫學方法等。傳統的微生物培養方法不僅耗時長，而且檢測的靈敏度不高;自聚合酶鏈式反應(PCR)技術問世以來，PCR技術在檢測食源性致病菌方面得到了廣泛的應用。PCR技術結合其他技術又衍生出許多PCR改良技術，如熒光定量PCR、即時PCR等，這些技術在檢測食源性致病菌方面，不僅耗時短，而且檢測的靈敏度高［3－4］。環介導等溫擴增技術(Loop－mediated isothermal amp lification，簡稱LAMP)是一種新的核酸擴增方法，其特點是在恒溫條件下保溫十幾分鐘，即可完成核酸擴增反應，能夠在1h之內，將目的DNA片段擴增109～ 1010倍［5］。Ethidium monozaide(EMA) 是 一 種DNA結合染料，能夠滲透到細胞壁(膜)不完整的菌體內，在光激活的條件下，易形成氮賓化合物與DNA或其他分子共價結合［6－7］，從而抑制死細胞DNA的擴增，而對活細胞的DNA不起作用。本實驗通過EMA的選擇滲透性與LAMP檢測技術相結合(EMALAMP)，檢測志賀氏菌活細胞基因ipaH，有效區分志賀氏菌的死/活細胞。

表1 EMA－LAMP反應引物序列

表2 脅迫條件對志賀氏菌的影響

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗菌株 購自中國普通微生物菌種保藏中心，菌株編號為1.1869;引物 上海英俊生物技術公司合成;Ethidium Monoazide，Betaine 美國 Sigma公司;Bst DNA聚合酶 BioLabs公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 志賀氏菌的培養條件 接種志賀氏菌到滅菌Luria－Bertani(LB)肉湯培養基中(1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、1%NaCl，pH7.5)，搖床培養過夜(37℃，120 r/m in)，使用涂布平板法檢測志賀氏菌可培養數為1.0×109CFU/m L。

1.2.2 脅迫條件 取1m L上述菌懸液于1.5m L的離心管中，按每隔15s放入3個管，分別置于95℃水浴鍋加熱處理，涂布營養瓊脂平板，37℃培養24h后觀察計數［8］。

1.2.3 EMA處理志賀氏菌活/死細胞 取志賀氏菌活/死細胞各1m L(1.0×109CFU/m L)置于無菌離心管中，分別加入不同濃度的EMA，并置于黑暗中常溫放置5min，然后將離心管放置在冰上，用650W鹵素燈曝光 10m in［9］。

1.2.4 志賀氏菌DNA制備 取細菌培養物1m L于12000r/min離心5min，棄上清并收集菌體，加入1m L細胞裂解液(2%Triton X－100，2.5mg/m L疊氮化鈉，溶解在0.1mol/L Tris－HCl中，pH8.0)，將沉淀充分混勻后，于100℃沸水浴10min，冰上放置5min，12000r/min離心5m in，上清即為 DNA模板，－20℃保存備用［10］，實驗中陰性對照采用滅菌的去離子水代替上清作為EMA－LAMP反應的模板。

1.2.5 EMA－LAMP反應體系 LAMP反應需要四條引物，包括兩條外引物(F3和B3)和兩條內引物(FIP和BIP)。它們能夠特異結合靶序列上的6個區域，選取GenBank發布的志賀氏菌攜帶的ipaH基因序列，在序列1075～1268bp設計LAMP反應的引物，見表1。EMA－LAMP反應體系為 10×Thermopol reaction buffer，1.6mmol/L dNTP，5mol/L betaine，6mmol/L MgSO4，Bst DNA聚合酶及內外引物，反應體系的體積為25μL。反應條件為65℃ 45min，80℃2m in，終止反應。反應結果通過2%的凝膠電泳檢測，電壓75V，電泳時間45m in，如果為陽性反應，則產生典型的階梯狀條帶，如果為陰性反應，則無條帶產生［11－12］。

1.2.6 不同EMA濃度處理志賀氏菌活/死細胞 取不同濃度的志賀氏菌活/死細胞各 1m L(1.0×109CFU/m L)置于無菌離心管中，分別加入不同濃度的EMA并置于黑暗中常溫放置5min，然后將離心管放置在冰上，用650W鹵素燈曝光10m in，按照1.2.4方法提取菌體DNA，作為LAMP反應的DNA模板進行 LAMP擴增和電泳分析［13］。

1.2.7 EMA處理不同活細胞比例志賀氏菌菌懸液

將上述菌懸液配制含有一定比例活細胞菌懸液混合體系，配制完成后，使體系中活細胞的數量分別為:1.0 ×106、1.0 × 105、1.0 × 104、1.0 × 103、1.0 × 102、1.0×101、1.0CFU/m L，向體系中加入40μg/m L(終濃度)EMA，置于黑暗中常溫放置5min，然后將離心管放置在冰上，用650W鹵素燈曝光10min，按照1.2.4方法提取菌體DNA，作為LAMP反應的DNA模板進行LAMP 擴增和電泳分析［12］。

1.2.8 優化曝光時間 取志賀氏菌活細胞菌懸液和死細胞菌懸液各1m L(1.0×107CFU/m L)置于無菌離心管中，加入40μg/m L(終濃度)EMA并置于黑暗中常溫放置5m in，然后將離心管放置在冰上，用650W鹵素燈曝光，選取曝光時間為1、5、10、15m in。提取菌體DNA，作為LAMP反應的DNA模板進行LAMP擴增和電泳分析［13］。

2 結果與討論

2.1 脅迫條件對志賀氏菌的影響

對菌懸液熱處理的結果見表2。從表中可以看出，在95℃的條件下，熱處理時間為90s時，平板菌落數為零，實驗過程中，為了確保細菌致死率為100%，實驗選擇脅迫條件為95℃，3m in。

2.2 不同濃度EMA對志賀氏菌活細胞菌懸液的影響

將菌液濃度為1.0×109CFU/m L的活細胞菌懸液使用EMA處理，取細胞裂解液進行LAMP擴增，產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳分析(見圖1)。結果表明，1.0×109CFU/m L的副溶血弧菌經過不同濃度的EMA處理后，仍然能夠擴增出特異性的階梯狀條帶，當EMA的濃度高達100μL/m L時，擴增出的條帶仍然比較清晰明亮，表明EMA對活菌細胞沒有影響或者影響不大。

圖1 不同濃度EMA對活菌(1.0×109 CFU/mL)的影響

2.3 不同濃度EMA對志賀氏菌死細胞菌懸液的影響

將菌液濃度為1.0×109CFU/m L的活細胞菌懸液進行熱處理(95℃，3m in)，熱處理后的菌懸液使用EMA處理后，取細胞裂解液進行LAMP擴增，產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳分析(見圖2)。從圖中可以看出，1.0×109CFU/m L熱處理的菌懸液在不使用EMA處理的情況下，能夠擴增出特異性的階梯狀的條帶，但是隨著EMA濃度的增加，其擴增產物的電泳條帶亮度逐漸減弱，當EMA的濃度達到40μg/m L或者更高濃度時，無擴增產物出現，40μg/m L EMA可以抑制1.0×109CFU/m L死細胞菌懸液DNA擴增。

圖2 不同濃度的EMA對死菌(1.0×109 CFU/mL)的影響

2.4 EMA溶液對不同活細胞比例志賀氏菌菌懸液的影響

將含不同比例的活細胞菌懸液進行熱處理(95℃，3m in)，熱處理后的菌懸液使用EMA處理，取細胞裂解液進行LAMP擴增，產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳分析(見圖3)，從圖中可以看出，隨著活細胞數目的降低，其擴增產物的電泳條帶亮度逐漸減弱，當活細胞數目降低到10CFU/m L時，EMA－LAMP沒有擴增條帶，說明當體系中活菌數目低于100CFU/mL，混合體系中死細胞的DNA就能夠被抑制，從而可以說明EMA－LAMP檢測細菌活/死細胞的靈敏度為100CFU/m L。

2.5 曝光時間對EMA－LAMP反應的影響

濃度為1.0×109CFU/m L的活細胞懸液使用40μg/m L的EMA進行處理，分別選擇曝光時間為1、5、10、15m in，EMA 處理后，用裂解法對細菌懸液細胞進行裂解，使用裂解液作為模板進行LAMP反應，結果如圖4所示，曝光時間從1～15m in均能擴增出特異性的階梯狀條帶。

圖3 40μg/mL的EMA對不同濃度比例活細胞菌懸液的影響

圖4 曝光時間對活菌的影響

將濃度為1.0×109CFU/m L的活菌細胞懸液使用熱處理的方法進行滅活后，使用40μg/m L的EMA進行處理，分別選擇曝光時間為 1、5、10、15m in，EMA處理后，用裂解法對細菌懸液細胞進行裂解，使用裂解液作為模板進行LAMP反應，結果如圖5所示，經過1m in曝光處理后，可抑制1.0×109CFU/m L的死細胞DNA的擴增。此結果與其他文獻報道的結果一致。綜合以上兩種結果，本實驗選擇的曝光時間為10m in，以確保多余的EMA能夠全部被光分解，從而不影響LAMP擴增的效果，同時花費的時間不是太長，能夠有效地控制檢測所需要的時間。

圖5 曝光時間對活菌的影響

3 討論

在國際上每年都有關于由志賀氏菌引起的食物中毒事件發生，給人類的身體健康、公共衛生等監控帶來了極大的挑戰。分子生物學方法能夠有效地檢測志賀氏菌，傳統的PCR技術可用于檢測包含活細胞和死細胞，因為盡管微生物細胞失去活力，其DNA仍然存在于環境中。因此，利用PCR選擇性擴增細菌活細胞DNA面臨著巨大挑戰。通過研究發現，可以將DNA染料與PCR方法結合，進行區分致病菌死活細胞，但是PCR方法依賴精密的溫度循環裝置，而且必須要在實驗室進行，因此一定程度上限制了其應用。

LAMP方法是一種新型的DNA擴增方法，該方法在恒溫條件下即可完成反應，沒有核酸的變復性過程，因此不需要特殊的儀器，只需要水浴鍋即可完成反應，比較適合在實驗室之外的地點進行檢測，因此LAMP應用更加廣泛。

EMA能夠滲透到細胞壁(膜)不完整的菌體內，在光激活的條件下，易形成氮賓化合物與DNA或其他分子共價結合，從而抑制死細胞DNA的擴增，而對活細胞的DNA不起作用。利用EMA與LAMP檢測技術結合，不僅可以有效區分病原菌的活死細胞，而且可以使反應迅速完成，反應的靈敏度也很高，可以達到100CFU/m L。本文采用EMA－LAMP檢測方法，有效區分志賀氏菌活死細胞，實驗證明，40μg/m L EMA足以抑制1.0×109CFU/m L死細胞菌懸液擴增，而對活細胞菌懸液的擴增則沒有影響，考慮到實際的病原菌的檢測中，109CFU/m L的菌液濃度已經是非常高的含菌量，所以實驗最終確定40μg/m L的EMA為最佳的檢測濃度。

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Differentiation of the viable and dead cells of Shigella by Loop－mediated isothermal amplificaiton with a DNA binding dye

LIYue，WANG Li，SUN Yuan－ming，ZHONG Qing－ping*

(College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China)

Conventional DNA－based detection methods can be used to detect both live and dead cells.Since dead cells do not cause disease，which bring a problem in medicalor biological studies.The Loop－mediated isothermal amplification(LAMP)method combined with the ethidium monoazide(EMA)treatment was applified with viable，but not dead Shigella cells.LAMP method em ploys a DNA polymerase and a set of specially designed primers that recognize a total of six distinct sequences on the target ipaH gene conserved in Shigella.The results showed that the concentration of EMA was 40μg/m L，DNA amplification was inhibited derived from dead cellsuspensions(1.0 ×109CFU/m L)，but not inhibit viable cells.These results showed that EMA－LAMP method had a potential for specific detection of viable cells，one hand，EMA had the ability to penetrate selectively through the damaged cytoplasmic membrane of dead cells and to intercalate into DNA，the gene of the dead cells could not be amplified.On the other hand，EMA－LAMP had high sensitivity and specificity.

ethidium monoazide;loop－mediated isothermal amplification;Shigella;viable－dead cell

Q789

A

1002－0306(2011)08－0216－04

2010－07－08 *通訊聯系人

李月(1982－)，女，碩士研究生，主要從事分子生物學方面的研究。

廣東省農業攻關重點專項(2009A020101004);國家自然科學基金(31000781)。