一株PHOTOBOICTERIUM LEIOGNATHI N1發光細菌的分離及鑒定

謝海平，吳亞梅，張 亮，王華接

(1.中山大學生命科學學院，廣東廣州 510275;

2.廣東省海洋與漁業環境監測中心，廣東廣州510222)

一株PHOTOBOICTERIUM LEIOGNATHI N1發光細菌的分離及鑒定

謝海平1，2，吳亞梅2，張 亮2，王華接2

(1.中山大學生命科學學院，廣東廣州 510275;

2.廣東省海洋與漁業環境監測中心，廣東廣州510222)

對從海魚(鯔魚)表面分離到的1株發光強度很高的細菌N1進行系統分類鑒定。采用常規方法進行分離培養，以形態學特征、培養特性、生理生化特征以及分子生物學等方法對其進行分類鑒定。結果可知，該菌株為兼性厭氧發酵型革蘭氏陰性桿菌，其16S rDNA核苷酸序列測定與Photoboicterium Leiognathi(鰒發光桿菌)的同源性達99.8%，系統進化樹也顯示，菌株N1與Photobacterium leiognathi構成一個分支;其形態特征與生理生化特性與Photoboicterium Leiognathi(鰒發光桿菌)完全吻合。確定此發光細菌為Photoboicterium Leiognathi(鰒發光桿菌)，命名為Photoboicterium Leiognathi N1。

Photoboicterium Leiognathi N1，發光細菌，分類鑒定，16S rDNA

發光細菌是一類在適宜條件下以及正常的生理條件下能夠發射可見光的異養細菌，這種可見熒光波長在450～490nm 之間，在黑暗處肉眼可見［1］。目前，全世界已發現和命名的發光細菌有11種，分別屬于弧菌屬(Vibrio)、發光桿菌屬(Photobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和異短桿菌屬(Xenorhabdus)［2－3］。它們除了在水中自由浮游生存外，還能寄生于其他生物體的體表、消化道和發光器官上以及水中的沉降物中。通過文獻［4］檢索可知，許多生物的發光與發光細菌有關，但不同種類發光細菌的發光機理是相同的，是由特異性的熒光酶(LE)、還原性的黃素(FHNH2)、八碳以上長碳脂肪醛(RCHO)以及氧分子(O2)所參與的復雜反應。我們采集了多個冰鮮魚(鯔魚)樣品，通過培養、分析、分離等方法得到一株發光強度很強的菌株N1，并對此進行了系統的分類研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品來源 從廣州白云區蕭崗農貿市場采集的多個冰鮮魚(鯔魚)樣品;發光細菌培養基［5］胰蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、甘油0.3%、KH2PO40.1%、Na2HPO40.5%、NaCl 3%、瓊脂2%，pH 6.5;營養瓊脂培養基、三糖鐵瓊脂培養基、檸檬酸鹽培養基、明膠蛋白胨培養基、1%賴氨酸脫羧酶、1%精氨酸雙水解酶等生化實驗反應管 廣東光華化學廠有限公司;分析純生化試劑、PCR反應引物、Taq DNA聚合酶、dNTP混合物等分子生物學試劑 深圳市華因賽生物技術有限公司。

表1 生理生化檢驗結果

1.2 實驗方法

1.2.1 發光細菌的培養及分離純化 首先擦拭冰海魚表面，用生理鹽水梯度稀釋，進行倒置培養，再挑取單個發光菌落劃線于營養瓊脂平板上，進行純化培養，按照革蘭氏染色的步驟進行初染、媒染、脫色及復染，在顯微鏡下觀察細菌的形態和染色特征。

1.2.2 發光細菌的鑒定 細菌的生理生化特征反應參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》［6］和《常見細菌系統鑒定手冊》［7］進行。

1.2.3 細菌16S rDNA序列的測定及分析

1.2.3.1 菌株基因組DNA的提取 提取菌株基因組DNA［8］，作為 PCR 反應模板。

1.2.3.2 引物的設計 根據細菌16S rDNA序列保守性設計合成引物［9］:

1.2.3.3 PCR擴增16S rDNA序列 反應體系:10×PCR反應緩沖液5μL、dNTP混合物1μL，上浮引物F和下游引物R各1μL，模板DNA 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，加無菌水補足體積為50μL。反應步驟:94℃預變性5min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，重復2～4 個步驟，30 個循環，72℃延伸7min。

1.2.3.4 16S rDNA序列的測序分析 將PCR反應擴增的16S rDNA片斷送至上海英駿生物技術服務有限公司進行測序，利用BLASTn(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)程序從GenBank基因庫中獲得16S rDNA序列，進行DNA序列比對和同源性分析，并用Clustalx 1.83建立系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 形態、染色及培養特性

該菌株為革蘭氏陰性桿狀菌，在固體營養瓊脂培養基中菌落表面光滑半透明，邊緣整齊，菌落大小約2mm。在黑暗環境下，有明顯的藍綠色熒光，在營養肉湯培養基中呈擴散性渾濁，接種于厭氧培養箱中培養，能比較微弱地生長。

2.2 N1菌株的生理生化特性

根據文獻對菌株N1的主要生理生化指標進行檢測，查《伯杰氏細菌鑒定手冊》［5］和《常見細菌系統鑒定手冊》［7］可知，該菌株 N1 與PhotoboicteriumLeiognathi(鰒發光桿菌)的生理特性最為相似。

2.3 16S rDNA測序分析

測序獲得菌株N1長度為1547bp的16S rDNA序列(圖1)，通過BLAST程序在NCBI網站的比對結果顯示:菌株N1的序列與Photoboicterium Leiognathi的16S核糖體序列相似性最高，達到99.8%(1463/1466)。

圖1 N1的16S rDNA序列

2.4 應用Clustalx 1.83軟件建立系統進化樹

系統進化樹圖2顯示，菌株N1與Photobacterium leiognathi構成一個分支，其親緣關系最近。

3 討論

本論文通過研究該細菌的形態學、培養特性、生理生化特征以及分子生物學特征，表明該菌株與發光桿菌屬的Photoboicterium Leiognathi(鰒發光桿菌)最為相似，同源性達99.8%。鑒定該細菌為Photoboicterium Leiognathi(鰒發光桿菌)，命名為Photoboicterium LeiognathiN1。這同時也說明了冰海魚(鯔魚)的發光現象是由于其體表和體內聚集大量的鰒發光桿菌繁殖所致。

圖2 根據菌株N1的16S rDNA序列構建的系統進化樹

根據文獻［10］檢索而知，發光細菌對人而言，沒有致病作用，因此，從市場上買回的海魚夜晚發出藍色的熒光，不必引起廣大市民的恐慌。另外，發光細菌在環保上有很大功效，可以分解海洋中的有機污染物、凈化海洋環境，在環境監測中，我們能結合現代的光電監測手段，作為測定環境中毒物的指標。

本實驗篩選出的Photoboicterium Leiognathi N1為開發利用發光細菌提供了新的資源，菌株N1作為發光細菌在這方面的應用未有相關報道，還有待于進一步的研究。

［1］黃正.發光細菌的生理特性及其在環境監測中的應用［J］.環境科學，1995，16(3):87－90.

［2］許鴻章，畢可紡，姜旭光.煙臺海域一株發光細菌的分離鑒定［J］.齊魯漁業，1990(3):38－40.

［3］Johng Holt，Noel R，Krieg H，et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology(Ninth Edition)［M］.Williams＆Wilkins Baltimore，1994:371－377.

［4］杜宗軍，王祥紅，李海峰，等.一株海洋發光細菌的分離鑒定及其發光條件的初步研究［J］.海洋湖沼通報，2003(2):58－63.

［5］侯靜濤，徐芙蓉，王廣啟，等.對一株海洋發光細菌保存方法的探究［J］.環境科學與管理，2008，33(10):167－169.

［6］布坎南R E，吉本期N E.伯杰氏細菌鑒定手冊［M］.第八版.北京科學出版社，1984.

［7］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京科學出版社，2001.

［8］Syn C K C，Swarup S.A Scalable Protocol for the Isolation of Large－Sized Genomic DNA within an hour from several Bacterial［J］.Analytical Biochemistry，2000，278:886－901.

［9］都立輝，劉芳.16S rDNA基因在細菌菌種鑒定中的應用［J］.乳業科學與技術，2006(5):207－209.

［10］明儒成，商文東，侯繼斌，等.一株ganghwense發光桿菌的分類鑒定及相關特性的研究［J］.微生物學雜志，2008，28(1):54－58.

Isolation and characterization of a luminous bacteria strain named Photoboicterium Leiognathi N1

XIE Hai－ping1，2，WU Ya－m ei2，ZHANG Liang2，WANG Hua－jie2

(1.School of Life Sciences，Sun Yat－sen University，Guangzhou 510275，China;
2.Guangdong Provincial Oceanic and Fishery Environment Monitoring Center，Guangzhou 510222，China)

A luminous bacteria strain N1 was isolated from a sea fish(mullet)，and it was classified systematically using routine methods，such as classified and characterized by its morpholog ical，cultural，physiological and biochemical features，and molecular biological.The results indicated that this strain belonged to facultative anaerobe fermentation and Gram－negative rod－shape bacteria.16S rDNA nuc leotide sequence testing showed it was most similar to Photoboic terium Leiognathi，and the homology was up to 99.8%.Phylogenetic tree also showed that N1 and Photobac terium leiognathi strains were from a batch.The cultural and physiological of this strain was totally identical to the Photoboicterium Leiognathi add itionally.So the strain was preliminary identified as Photoboicterium Leiognathi N1.

Photoboic terium Leiognathi N1;luminous bacteria;classification and identification;16S rDNA

TS201.2

A

1002－0306(2011)08－0230－03

2010－07－15

謝海平(1974－)，男，工程師，主要從事水產品藥物殘留檢測及質量安全管理方面的研究。