一株P(guān)HOTOBOICTERIUM LEIOGNATHI N1發(fā)光細(xì)菌的分離及鑒定

謝海平，吳亞梅，張 亮，王華接

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275;

2.廣東省海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測中心，廣東廣州510222)

一株P(guān)HOTOBOICTERIUM LEIOGNATHI N1發(fā)光細(xì)菌的分離及鑒定

謝海平1，2，吳亞梅2，張 亮2，王華接2

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275;

2.廣東省海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測中心，廣東廣州510222)

對從海魚(鯔魚)表面分離到的1株發(fā)光強(qiáng)度很高的細(xì)菌N1進(jìn)行系統(tǒng)分類鑒定。采用常規(guī)方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，以形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特征以及分子生物學(xué)等方法對其進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果可知，該菌株為兼性厭氧發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，其16S rDNA核苷酸序列測定與Photoboicterium Leiognathi(鰒發(fā)光桿菌)的同源性達(dá)99.8%，系統(tǒng)進(jìn)化樹也顯示，菌株N1與Photobacterium leiognathi構(gòu)成一個(gè)分支;其形態(tài)特征與生理生化特性與Photoboicterium Leiognathi(鰒發(fā)光桿菌)完全吻合。確定此發(fā)光細(xì)菌為Photoboicterium Leiognathi(鰒發(fā)光桿菌)，命名為Photoboicterium Leiognathi N1。

Photoboicterium Leiognathi N1，發(fā)光細(xì)菌，分類鑒定，16S rDNA

發(fā)光細(xì)菌是一類在適宜條件下以及正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見光的異養(yǎng)細(xì)菌，這種可見熒光波長在450～490nm 之間，在黑暗處肉眼可見［1］。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)和命名的發(fā)光細(xì)菌有11種，分別屬于弧菌屬(Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和異短桿菌屬(Xenorhabdus)［2－3］。它們除了在水中自由浮游生存外，還能寄生于其他生物體的體表、消化道和發(fā)光器官上以及水中的沉降物中。通過文獻(xiàn)［4］檢索可知，許多生物的發(fā)光與發(fā)光細(xì)菌有關(guān)，但不同種類發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理是相同的，是由特異性的熒光酶(LE)、還原性的黃素(FHNH2)、八碳以上長碳脂肪醛(RCHO)以及氧分子(O2)所參與的復(fù)雜反應(yīng)。我們采集了多個(gè)冰鮮魚(鯔魚)樣品，通過培養(yǎng)、分析、分離等方法得到一株發(fā)光強(qiáng)度很強(qiáng)的菌株N1，并對此進(jìn)行了系統(tǒng)的分類研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品來源 從廣州白云區(qū)蕭崗農(nóng)貿(mào)市場采集的多個(gè)冰鮮魚(鯔魚)樣品;發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)基［5］胰蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、甘油0.3%、KH2PO40.1%、Na2HPO40.5%、NaCl 3%、瓊脂2%，pH 6.5;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、明膠蛋白胨培養(yǎng)基、1%賴氨酸脫羧酶、1%精氨酸雙水解酶等生化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)管 廣東光華化學(xué)廠有限公司;分析純生化試劑、PCR反應(yīng)引物、Taq DNA聚合酶、dNTP混合物等分子生物學(xué)試劑 深圳市華因賽生物技術(shù)有限公司。

表1 生理生化檢驗(yàn)結(jié)果

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)及分離純化 首先擦拭冰海魚表面，用生理鹽水梯度稀釋，進(jìn)行倒置培養(yǎng)，再挑取單個(gè)發(fā)光菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂平板上，進(jìn)行純化培養(yǎng)，按照革蘭氏染色的步驟進(jìn)行初染、媒染、脫色及復(fù)染，在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特征。

1.2.2 發(fā)光細(xì)菌的鑒定 細(xì)菌的生理生化特征反應(yīng)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［6］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［7］進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA序列的測定及分析

1.2.3.1 菌株基因組DNA的提取 提取菌株基因組DNA［8］，作為 PCR 反應(yīng)模板。

1.2.3.2 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列保守性設(shè)計(jì)合成引物［9］:

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增16S rDNA序列 反應(yīng)體系:10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL、dNTP混合物1μL，上浮引物F和下游引物R各1μL，模板DNA 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，加無菌水補(bǔ)足體積為50μL。反應(yīng)步驟:94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，重復(fù)2～4 個(gè)步驟，30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。

1.2.3.4 16S rDNA序列的測序分析 將PCR反應(yīng)擴(kuò)增的16S rDNA片斷送至上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，利用BLASTn(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)程序從GenBank基因庫中獲得16S rDNA序列，進(jìn)行DNA序列比對和同源性分析，并用Clustalx 1.83建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)、染色及培養(yǎng)特性

該菌株為革蘭氏陰性桿狀菌，在固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中菌落表面光滑半透明，邊緣整齊，菌落大小約2mm。在黑暗環(huán)境下，有明顯的藍(lán)綠色熒光，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中呈擴(kuò)散性渾濁，接種于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，能比較微弱地生長。

2.2 N1菌株的生理生化特性

根據(jù)文獻(xiàn)對菌株N1的主要生理生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，查《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［5］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［7］可知，該菌株 N1 與PhotoboicteriumLeiognathi(鰒發(fā)光桿菌)的生理特性最為相似。

2.3 16S rDNA測序分析

測序獲得菌株N1長度為1547bp的16S rDNA序列(圖1)，通過BLAST程序在NCBI網(wǎng)站的比對結(jié)果顯示:菌株N1的序列與Photoboicterium Leiognathi的16S核糖體序列相似性最高，達(dá)到99.8%(1463/1466)。

圖1 N1的16S rDNA序列

2.4 應(yīng)用Clustalx 1.83軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹

系統(tǒng)進(jìn)化樹圖2顯示，菌株N1與Photobacterium leiognathi構(gòu)成一個(gè)分支，其親緣關(guān)系最近。

3 討論

本論文通過研究該細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性、生理生化特征以及分子生物學(xué)特征，表明該菌株與發(fā)光桿菌屬的Photoboicterium Leiognathi(鰒發(fā)光桿菌)最為相似，同源性達(dá)99.8%。鑒定該細(xì)菌為Photoboicterium Leiognathi(鰒發(fā)光桿菌)，命名為Photoboicterium LeiognathiN1。這同時(shí)也說明了冰海魚(鯔魚)的發(fā)光現(xiàn)象是由于其體表和體內(nèi)聚集大量的鰒發(fā)光桿菌繁殖所致。

圖2 根據(jù)菌株N1的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

根據(jù)文獻(xiàn)［10］檢索而知，發(fā)光細(xì)菌對人而言，沒有致病作用，因此，從市場上買回的海魚夜晚發(fā)出藍(lán)色的熒光，不必引起廣大市民的恐慌。另外，發(fā)光細(xì)菌在環(huán)保上有很大功效，可以分解海洋中的有機(jī)污染物、凈化海洋環(huán)境，在環(huán)境監(jiān)測中，我們能結(jié)合現(xiàn)代的光電監(jiān)測手段，作為測定環(huán)境中毒物的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)篩選出的Photoboicterium Leiognathi N1為開發(fā)利用發(fā)光細(xì)菌提供了新的資源，菌株N1作為發(fā)光細(xì)菌在這方面的應(yīng)用未有相關(guān)報(bào)道，還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］黃正.發(fā)光細(xì)菌的生理特性及其在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用［J］.環(huán)境科學(xué)，1995，16(3):87－90.

［2］許鴻章，畢可紡，姜旭光.煙臺(tái)海域一株發(fā)光細(xì)菌的分離鑒定［J］.齊魯漁業(yè)，1990(3):38－40.

［3］Johng Holt，Noel R，Krieg H，et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology(Ninth Edition)［M］.Williams＆Wilkins Baltimore，1994:371－377.

［4］杜宗軍，王祥紅，李海峰，等.一株海洋發(fā)光細(xì)菌的分離鑒定及其發(fā)光條件的初步研究［J］.海洋湖沼通報(bào)，2003(2):58－63.

［5］侯靜濤，徐芙蓉，王廣啟，等.對一株海洋發(fā)光細(xì)菌保存方法的探究［J］.環(huán)境科學(xué)與管理，2008，33(10):167－169.

［6］布坎南R E，吉本期N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊［M］.第八版.北京科學(xué)出版社，1984.

［7］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京科學(xué)出版社，2001.

［8］Syn C K C，Swarup S.A Scalable Protocol for the Isolation of Large－Sized Genomic DNA within an hour from several Bacterial［J］.Analytical Biochemistry，2000，278:886－901.

［9］都立輝，劉芳.16S rDNA基因在細(xì)菌菌種鑒定中的應(yīng)用［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2006(5):207－209.

［10］明儒成，商文東，侯繼斌，等.一株ganghwense發(fā)光桿菌的分類鑒定及相關(guān)特性的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(1):54－58.

Isolation and characterization of a luminous bacteria strain named Photoboicterium Leiognathi N1

XIE Hai－ping1，2，WU Ya－m ei2，ZHANG Liang2，WANG Hua－jie2

(1.School of Life Sciences，Sun Yat－sen University，Guangzhou 510275，China;
2.Guangdong Provincial Oceanic and Fishery Environment Monitoring Center，Guangzhou 510222，China)

A luminous bacteria strain N1 was isolated from a sea fish(mullet)，and it was classified systematically using routine methods，such as classified and characterized by its morpholog ical，cultural，physiological and biochemical features，and molecular biological.The results indicated that this strain belonged to facultative anaerobe fermentation and Gram－negative rod－shape bacteria.16S rDNA nuc leotide sequence testing showed it was most similar to Photoboic terium Leiognathi，and the homology was up to 99.8%.Phylogenetic tree also showed that N1 and Photobac terium leiognathi strains were from a batch.The cultural and physiological of this strain was totally identical to the Photoboicterium Leiognathi add itionally.So the strain was preliminary identified as Photoboicterium Leiognathi N1.

Photoboic terium Leiognathi N1;luminous bacteria;classification and identification;16S rDNA

TS201.2

A

1002－0306(2011)08－0230－03

2010－07－15

謝海平(1974－)，男，工程師，主要從事水產(chǎn)品藥物殘留檢測及質(zhì)量安全管理方面的研究。