蓮房原花青素的提取純化技術研究

崔 倩，蔣益虹，戴 蕾，林 穎

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州 310029)

蓮房原花青素的提取純化技術研究

崔 倩，蔣益虹*，戴 蕾，林 穎

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州 310029)

對蓮房原花青素的提取純化工藝條件進行了研究，得到較優提取工藝為:提取溫度50℃，提取溶劑60%乙醇，料液比1∶30，提取時間30min。采用大孔吸附樹脂D－101、DA－201、DM－301和聚酰胺樹脂對原花青素進行純化，結果表明，大孔樹脂DA－201對蓮房原花青素有較好的吸附和洗脫效果，以70%乙醇為洗脫劑，初步得到純化的蓮房原花青素，洗脫率為84.1%。

蓮房，原花青素，提取，純化

蓮房為蓮科藥用植物蓮(Nelumbo Nucifera Gaertn.)的成熟花托(又名蓮蓬殼，Seedpod of the Lotus，簡稱LS)。蓮花歷史悠久，我國約有二百種不同種型的蓮。蓮在我國種植廣泛，據報道，1999年種植面積就已經超過了40000hm2［1］。蓮子和蓮藕是人們喜愛的食品，而蓮房經常都被當作廢棄物大量丟棄?！侗静菥V目》中記載，荷花、蓮子、蓮衣、蓮房、蓮須、蓮子心、荷葉、荷梗、藕節等均可藥用。蓮房體輕，質疏松，縱向破開多裂隙似海綿，棕色。蓮房中含有蛋白質、脂肪、糖類、粗纖維、胡蘿卜素、VB、尼克酸、VC及微量蓮子堿等多種化學成分［2］，為傳統中藥材，具有消淤、止血祛濕之功效。近年報道，蓮房中富含原花青素——蓮房原花青素(procyanidins of lotus seedpod，簡稱LSPC)，是蓮房的主要活性成分之一?，F代生物活性研究表明，LSPC具有較強的清除自由基和抗脂質過氧化活性［1］、抗心肌缺血［3］、調節血脂［4］、抑制癌細胞生長［5］及防輻射［6］等多種生物活性和藥理作用。然而，目前國內外對于蓮房原花青素的研究多集中在活性功能方面。本研究旨在建立較完善的蓮房原花青素的提取、純化方法，為蓮房資源的綜合利用開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮房 將一定量新鮮(去籽)蓮房清潔干凈，撕片，65℃干燥至恒重，粉碎，過100目篩，于干燥避光處保存備用;兒茶素對照品 中國藥品生物制品檢定所;聚酰胺樹脂 浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠;大孔吸附樹脂 DA－201、DM－301、D－101 天津市海光化工有限公司;無水乙醇、NaOH、冰乙酸等分析純。

722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;循環水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設備有限公司;HL－2恒流泵 上海精科實業有限公司;Z系列層析柱、BS－100A自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 原花青素含量的測定(香草醛法)

1.2.1 標準曲線 精確稱取兒茶素對照品約10mg，用蒸餾水溶解后，轉移到10m L容量瓶中定容，搖勻，作為母液備用。分別精密吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5m L標準品母液，置于10m L容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。用香草醛法(取1m L樣品于10m L具塞玻璃管中，加入2.5m L濃度為30g/L的香草醛－甲醇溶液，再加入2.5m L濃度為30%的硫酸－甲醇溶液，搖勻，避光反應10m in，以去離子水為空白，在最大吸收波長500nm處測定吸光值)，以濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標，得出回歸方程。

所取標準液的濃度和吸光度值數據經回歸處理，計算得回歸方程為 y=2.2868x+0.023，R2=0.9998;其中x為兒茶素濃度，y為波長500nm處測定的吸光度值。結果表明兒茶素濃度在0.052～0.26mg/m L范圍內與吸光度值線性關系良好。

1.2.2 原花青素含量測定 取1m L樣品于10m L具塞玻璃管中，加入2.5m L濃度為30g/L的香草醛－甲醇溶液，再加入2.5m L濃度為30%的硫酸－甲醇溶液，搖勻，避光反應10m in，以去離子水為空白，在最大吸收波長500nm處測定吸光值［7］。

1.3 蓮房原花青素的提取

準確稱取蓮房粉末2g，加入一定量一定濃度的乙醇溶液，于一定溫度(水浴)提取一次，每5min振搖一下。提取一定時間后進行抽濾，濾液定容至100m L，取4m L再定容至50m L，取1m L測定原花青素含量。

1.4 蓮房原花青素的柱層析純化

1.4.1 樹脂的篩選 選擇4種樹脂，樹脂用95%乙醇浸泡24h，用蒸餾水洗至無酒精味;再用1%NaOH浸泡3～4h，濾掉上層堿液，以蒸餾水洗至中性;用4倍量10%醋酸浸泡3～4h，再用蒸餾水洗至中性并浸泡備用［8］。

準確稱取處理好的樹脂10g(抽濾去除樹脂表面水分)，置于200m L三角瓶中，加入40m L原花青素粗提液，置于氣浴恒溫振蕩器，30℃、120r/min振蕩24h。取上清液 2m L用蒸餾水定容至 50m L，在500nm處用香草醛法測定濾液的吸光值［9］得到靜態吸附率。取吸附平衡的樹脂，用蒸餾水沖洗樹脂至濾液無色，置于三角瓶中加入100m L 90%乙醇洗脫樹脂，于氣浴恒溫振蕩器30℃、120 r/m in振蕩24h，測定洗脫液的吸光度得到靜態解吸率。通過對吸附量、吸附率和解吸率的比較選擇一種合適的樹脂。

1.4.2 靜態吸附與解吸附

1.4.2.1 靜態吸附動力學測定 稱取已處理好的樹脂10g，置于200m L三角瓶中，加入40m L原花青素粗提液，不時振蕩，每隔30min取1m L溶液定容至10m L，用香草醛法在500nm測定吸光值，連續測定4h左右，觀察樹脂對原花青素的吸附量與時間的關系。

1.4.2.2 靜態吸附等溫線測定 稱取6份已處理好的大孔樹脂DA－201，各2.5g，分別置于100m L三角瓶中，加入10m L不同濃度的原花青素粗提液，搖床振蕩(30℃、120r/min)，1h后取 1m L溶液定容至10m L，用香草醛法在500nm處測定吸光值。

1.4.3 動態吸附與解吸附

1.4.3.1 層析柱的制備和上樣 稱取80g備用樹脂DA－201，濕法裝入內徑25mm、高40cm的玻璃交換柱中，樹脂層高度約為25cm。待層析柱中的蒸餾水流盡后，室溫下以上樣流速0.8m L/m in進樣，進樣濃度為2.33mg/m L的原花青素粗提液150m L。

1.4.3.2 層析柱的洗脫 室溫下用相同的流速上蒸餾水，洗下樹脂中水溶性的雜質。大約100m L蒸餾水可洗脫干凈。待水洗流出液為無色后，用50%的乙醇溶液沖洗樹脂吸附柱，洗脫液以0.8m L/m in的速度洗脫，采用部分收集器每5m in收集一管，按順序記為1，2，3……36，再用可見光分光光度計于波長500nm處用香草醛法檢測吸光值，觀察洗脫出峰情況。

1.4.3.3 比較不同濃度乙醇的洗脫效果 按照上文所述的上樣方法上樣，吸附結束后，先用100m L的蒸餾水洗去水溶性雜質，再分別選用50%、70%、90%乙醇溶液作為洗脫劑，以0.8m L/m in的洗脫速度對吸附飽和的大孔樹脂進行洗脫。收集洗脫流出液測定原花青素含量，計算洗脫率。

2 結果與分析

2.1 蓮房原花青素提取工藝的研究

2.1.1 單因素實驗 在其它條件相同的情況下，乙醇濃度、提取溫度、時間和料液比對提取效果的影響結果見圖1～圖4。

圖1 乙醇濃度對蓮房原花青素提取率的影響

圖2 溫度對蓮房原花青素提取率的影響

圖3 提取時間對蓮房原花青素提取率的影響

圖4 料液比對蓮房原花青素提取率的影響

由圖1可見，乙醇濃度達到60%時，原花青素的提取率最高，再升高原花青素提取率已略有下降的趨勢，分析產生這種現象的原因可能是隨著乙醇濃度的增大，一些醇溶性雜質、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與原花青素競爭同乙醇－水分子結合，從而導致提取率降低［10］。圖2表明，隨著溫度的升高，原花青素的提取率有升高的趨勢，但是在工業中溫度的升高需要付出較大的成本，而且溫度升高容易破壞一些活性成分，因而選擇50～60℃比較合適。由圖3可見，時間對提取率的影響不大，20m in基本已經達到提取完畢的效果，隨著時間的延長，提取率反而有減少的現象，很可能是原花青素長時間加熱被破壞。圖4表明，料液比從1∶15到1∶30，提取率有顯著的增長，而之后再增加溶劑體積，提取率開始下降，因此認為1∶30為合適的料液比。

2.1.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，應用正交實驗四因素三水平設計，考察提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時間對蓮房中原花青素提取效果的影響，并分析得到較優的實驗組合。因素水平安排如表1。

表1 因素水平表

表2 正交實驗方案及結果

由表2實驗結果可見，蓮房中原花青素的最佳提取工藝為:提取溫度50℃，提取溶劑60%乙醇，料液比1∶30，提取時間30m in。各種因素對提取效果影響的主次順序依次為乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間。通過極差分析檢驗可知，4種因素對提取率均有影響。

2.2 蓮房原花青素的柱層析純化

2.2.1 樹脂的篩選結果 根據表3，聚酰胺樹脂的吸附率與吸附量均最大，但是解析率最小，這對于原花青素原料會有很大的浪費，且不利于樹脂的重復利用;D－101的解析率最高但是吸附率最小，會導致純化的效率低下;綜合考慮吸附率與解析率，認為大孔樹脂DA－201為最佳的選擇。

表3 不同樹脂對蓮房原花青素的吸附與解析

2.2.2 大孔樹脂DA－201的靜態吸附與解吸附

2.2.2.1 吸附動力學 大孔樹脂DA－201對原花青素的吸附率與時間的關系見圖5?？梢钥闯?，大孔樹脂DA－201的吸附速度很快，30m in基本已經達到吸附飽和，飽和吸附率在36%左右。因此應使吸附時間大于30m in，以確保吸附平衡。

圖5 大孔樹脂DA－201對蓮房原花青素的吸附動力學曲線

2.2.2.2 靜態吸附等溫線測定 不同濃度下樹脂對原花青素的吸附量關系如圖6。由圖6可見，原花青素在樹脂上的吸附量隨著提取液濃度的增加而增大。但同時，吸附率會隨著提取液濃度的增加而減小，所以選擇濃度時要綜合考慮。樹脂的吸附率一般與上樣溶液的濃度成反比，通常以較低濃度進行吸附較為有利，如果上樣濃度偏高，則吸附率會顯著減少［11］。

圖6 大孔樹脂DA－201對蓮房原花青素的吸附等溫線

2.2.3 大孔樹脂DA－201的動態吸附與解吸附 動態上樣的吸附曲線如圖7。

由圖7可見，當流出液為74m L時，樹脂達到飽和吸附，飽和吸附量為3.4mg/g濕樹脂。

圖7 大孔樹脂DA－201吸附動力學曲線

以原花青素濃度(mg/m L)對洗脫液體積(m L)作圖得動態解吸曲線，如圖8。

圖8 洗脫曲線

從圖8可見，乙醇溶液通過50m L左右時，原花青素開始被洗脫下來，然后迅速達到高峰，乙醇溶液通過120m L后，洗脫液濃度基本保持在一個低點，有拖尾現象。

2.2.4 比較不同濃度乙醇的洗脫效果 不同濃度乙醇的洗脫率見表4。

表4 不同濃度乙醇的洗脫效果

由表4可知，70%乙醇的洗脫能力高于其他2種濃度的乙醇溶液，為比較適合的洗脫劑，洗脫率可達84.1%。

分別合并收集到的洗脫液，在40℃減壓蒸餾除去洗脫液中的乙醇和水，通過噴霧干燥可得原花青素產品為淺黃色粉末。

3 結論

3.1 對原花青素的提取條件進行了探討，結果表明，蓮房中原花青素的最佳提取工藝為:提取溫度50℃，提取溶劑 60%乙醇，料液比1∶30，提取時間30m in。在此條件下，采用硫酸－香草醛法，以兒茶素為對照品，測定蓮房粉中原花青素的干基含量為7.58%，比一般葡萄籽原花青素的得率(4.6%)高，因此它是一種新的、很有應用前景的原花青素生產原料。

3.2 綜合 3種大孔吸附樹脂 D－101、DA－201、DM－301和聚酰胺樹脂的靜態吸附－解吸附性能，可以看出，大孔吸附樹脂DA－201是最合適的原花青素純化樹脂，具有吸附快、易解吸等特點。

3.3 以DA－201為填充料制備層析柱，上樣流速0.8m L/m in，2.33mg/m L的原花青素粗提液達到吸附飽和的時間為92m in，濕樹脂的動態飽和吸附量為3.4mg/g。相同流速下，100m L的蒸餾水可以洗去溶于水的雜質。

3.4 分別選用50%、70%、90%乙醇溶液作為洗脫劑，得到洗脫率最高的為70%的乙醇。上柱液濃度為2.97mg/m L，流速為0.8m L/m in時，70%的乙醇溶液洗脫率達到84.1%，且出峰快，但有拖尾現象。

［1］ZHI－QUN LING，BI－JUN XIE，ER－LING YANG.Isolation，Characterization，and Determination of Antioxidative Activity of Oligomeric Procyanidins from the Seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn［J］.J Agric Food Chem，2005，53:2441－2445.

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Study on the extraction and purification of procyanidins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn.

CUI Qian，JIANG Yi－hong*，DAILei，LIN Ying

(Bioengineering ＆ Food Science College of Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

The extraction and purification technology of the procyanid ins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn.were studied.The optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 50℃，ethanol concentration 60%，the ratio of sample to solvent volume(W/V)1∶30，extraction time 30m in.Under this condition，the yield of procyanid ins was 7.5%.The procyanid ins were further purified with macroporous resins D－101，DA－201，DM－301 and polyamide resin，the results showed that the resin DA－201 had better adsorption and elution of procyanid ins from the lotus seedpod.The ratio of stripping was 84.1%when eluting with 70%ethanol.

lotus seedpod;procyanidins;extraction;purification

TS201.2

B

1002－0306(2011)08－0238－04

2010－01－15 *通訊聯系人

崔倩(1985－)，女，碩士研究生，從事天然產物方面的研究。

浙江省教育廳課題(N20080086);浙江省科技廳項目(N20080439)。