香柏總酚酸提取工藝優化

伏勁松，蔡光華，楊 梅，王曉玲

(西南民族大學少數民族藥物研究所，四川成都 610041)

香柏總酚酸提取工藝優化

伏勁松，蔡光華，楊 梅，王曉玲*

(西南民族大學少數民族藥物研究所，四川成都 610041)

目的:優化香柏總酚酸的提取工藝。方法:利用回流提取方法進行提取，用七因素二水平正交實驗確定影響提取的主要因素，然后用正交回歸實驗確定主要影響因素的最佳水平。結果:影響香柏總酚酸提取率的因素順序為:乙醇濃度＞液固比＞提取時間＞回流溫度＞浸泡時間＞pH＞提取次數?；亓魈崛〉淖罴压に嚄l件:乙醇濃度(V/V)為81.38%，液固比為28.89∶1(mL/g)，提取時間為37.5min。在最佳工藝條件下，最大提取率可達2.779g/100g。結論:該方法操作簡單、方便適用，可以用于工業化生產。

香柏，總酚酸，正交回歸，提取率

酚酸是一類在植物中廣泛存在的多酚類物質，在植物的根、徑、葉、果、皮中均含有酚酸類化合物;其分子結構中存在多個酚羥基，植物酚酸具有較強的抗氧化作用，以及明顯的抑菌、抗癌、抗衰老和抑制膽固醇上升等功效，攝入一定量的酚酸可以有效地預防多種疾病的發生［1－6］。香柏(Sabina Pingii var.Wilsonii)為柏科圓柏屬植物，在我國主要分布于四川、云南、青海、西藏等高海拔地區。通過預實驗發現，香柏中存在較大量的酚酸類成分。通過藥理實驗發現，香柏中的酚酸具有抗癌、抗HIV及其反轉錄病毒的細胞活性。但國內外至今未見香柏總酚酸提取工藝的研究報道。本文采用回流的方法提取香柏中的總酚酸，為促進該植物的進一步研究和有效開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香柏 2008年9月采自四川小金縣，經本課題組鑒定為柏科圓柏屬植物香柏Sabina pingii(Cheng ex Ferre)var.wilsonii(Rehd.)Cheng et L.K.Fu，標本標號SXWX2009－9－01，現保存于西南民族大學少數民族藥物標本室;沒食子酸 由本實驗室從五倍子中分離純化，其結構經 MS、UV、IR、1H NMR、13C NMR譜進行結構表征，純度經HPLC分析大于99.5%。

北京普析通用 UV－1901紫外分光光度計，METTLER AE240電子天平，SENCO W 201－恒溫水浴鍋，pHS－2C型精密酸度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 香柏枝葉→自然陰干→粉碎→精密稱取50.0g于3000mL圓底燒瓶中→乙醇水回流提取→抽濾→濾液濃縮成浸膏→25℃真空干燥至恒重→香柏總酚酸提取物

1.2.2 香柏總酚酸的提取條件優化

1.2.2.1 正交實驗條件的優化 選用七因素二水平正交實驗對影響提取率的回流溫度、液固比、提取次數、pH、提取時間、乙醇濃度、浸泡時間進行考察，以確定影響提取率的主要因素，因素水平見表1。

1.2.2.2 二次正交回歸旋轉組合實驗條件的優化

根據七因素二水平正交實驗的結果，設計乙醇濃度、液固比、提取時間三因素二水平正交回歸旋轉組合實驗設計進行實驗(其他條件固定為回流溫度80℃、浸泡時間45min、pH9、提取次數2次)，每組實驗平行進行三次，取平均值。實驗結果用SAS統計軟件包進行回歸優化，并令優化后的方程的一階偏導數為零，求解出最佳提取工藝條件。因子水平編碼表見表2。

表1 正交實驗因素水平表L8(27)

表3 正交實驗結果L8(27)

表2 因子水平編碼表

1.2.3 標準曲線的制作 精密稱取干燥至恒重的沒食子酸57.9mg，置50m L容量瓶中，溶解后，加無水乙醇定容至刻度。精密吸取0.2m L溶液至50m L容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度。配成濃度為0.0232mg/m L的標準品溶液。分別精密量取2、4、6、8、10m L的上述沒食子酸標準品(0.0232mg/m L)儲備液，加入無水乙醇9m L，振搖溶解，置于25m L容量瓶中，靜置5min，加入0.3%十二烷基磺酸鈉溶液2m L，0.6%FeCl3－0.9%K3［Fe(CN)6］(1∶1)混合溶液1m L，放置5m in，用1mol/L的鹽酸溶液定容，放置20m in。以未加樣品，按照前述相同方法進行操作的溶液做空白液。在701.5nm波長處測定吸光度A值，以 A值(y)為縱坐標、沒食子酸的濃度(x，mg/m L)為橫坐標做線性回歸。

1.2.4 原料香柏總酚酸的含量測定 精密稱取按1.2.1方法制取的香柏浸膏約27mg(相當于1g干香柏原藥)放入50m L容量瓶中，按照1.2.3方法進行顯色并測定吸光度，根據標準曲線計算出總酚酸的量，按下式計算總酚酸的提取率:

香柏總酚酸的提取率(%)=(提取總酚酸的質量/香柏干粉的質量)×100%

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

按1.2.3方法制作標準曲線，結果見圖1。

圖1 沒食子酸的標準曲線

對數據進行線性回歸得標準曲線為:y=242.34x+0.3418，R2=0.9999。結果表明沒食子酸濃度在1.85～9.26μg/m L之間呈線性關系，滿足含量測定要求。

2.2 正交實驗結果及分析

2.2.1 正交實驗結果 見表3。

2.2.2 正交實驗結果分析 根據表3實驗結果，由極差可以確定影響提取率因素的大小次序為:F＞B＞E＞A＞G＞D＞C;即乙醇濃度＞液固比＞提取時間＞回流溫度＞浸泡時間＞pH＞提取次數。最佳提取條件為F1B2E1A1G2D1C2，即乙醇濃度(V/V)60%、液固比30∶1、提取時間 30min、回流溫度 80℃、浸泡時間45m in、pH=9、提取次數2次的工藝條件為最佳實驗組合，此條件下總酚酸的提取率較高。

2.3 二次正交回歸旋轉組合實驗

2.3.1 二次正交回歸旋轉組合實驗結果 見表4。

2.3.2 正交回歸實驗結果分析 對表4的結果用SAS統計軟件包進行分析［7］，得回歸方程為:y=2.76153+0.080201X1+0.15434X2+0.04219X3－0.08670X1X1－0.08975X1X2+0.13650X1X3－0.39652X2X2－0.13475X2X3－0.34332X3X3

表4 正交回歸實驗結果

由方差分析可以看出，常數項、一次項X2、二次項X2X2、X3X3對結果的影響是非常顯著的，其余項對結果的影響不顯著，回歸方程顯著統計程度P＜0.0001，因此，可以用該回歸方程代替真實點對實驗結果進行分析。決定系數R2=0.9557，即回歸方程中所有自變量的變化可以解釋95.57%的因變量變化，其主要原因在于提取過程受眾多因素的影響，回歸方程并未計入所有的變量;同時由于實驗的隨機誤差對回歸方程也有一定的影響。

2.3.3 回歸方程的優化［8］采用逐步向前回歸選擇法刪除回歸方程中顯著性小于0.1的項，得回歸方程為:y=2.76153+0.08021X1+0.15434X2－0.08670X1X1－0.39652X2X2－0.34332X3X3刪除變量后的方程顯著統計程度P＜0.0001，決定系數R2=0.8859，即刪除變量后，回歸方程的自變量變化可以解釋88.59%的因變量變化，結果較好。

回歸方程分別對X1、X2、X3求一階偏導并等于零，求得 X1=0.925，X2=0.389，X3=0，即最佳工藝條件為:乙醇濃度(V/V)為:81.38%，液固比為:28.89∶1(m L/g)，提取時間為:37.5m in。預測最大值為:2.789g/100g。經驗證實驗，在最佳提取工藝條件下總酚酸提取率可達2.779g/100g，誤差為1%。

3 結論

3.1 正交實驗結果表明，影響香柏總酚酸提取率大小的因素的主次順序為:乙醇濃度＞液固比＞提取時間＞回流溫度＞浸泡時間＞pH＞提取次數。

3.2 正交回歸實驗研究結果表明，香柏總酚酸提取率的數學模型可用y=2.76153+0.080201X1+0.15434X2+0.04219X3－0.08670X1X1－0.08975X1X2+0.13650X1X3－0.39652X2X2－0.13475X2X3－0.34332X3X3來表示。香柏總酚酸的最佳工藝條件為:乙醇濃度(V/V)為:81.38%，液固比為:28.89∶1(m L/g)，提取時間為:37.5m in。在最佳工藝條件下最大提取率可達2.779g/100g。

［1］韓丙軍，彭黎旭.植物多酚提取技術及其開發應用現狀［J］.華南熱帶農業大學學報，2005，11(1):22－26.

［2］劉運榮，胡健華.植物多酚的研究進展［J］.武漢工業學院學報，2005，24(4):63－65.

［3］金瑩，孫愛東.植物多酚的結構及生物學活性研究［J］.中國食物與營養，2005(9):27－29.

［4］KgNevin，T Rajamohan.Beneficial effects of virgin coconut oil on lipid parameters and in vitro LDL oxidation［J］.Clinical Biochemistry，2004，37:830－835.

［5］石碧，狄瑩 .植物多酚［M］.北京:科學出版社，2000:19－318.

［6］張力平，孫長霞，李俊清，等.植物多酚研究現狀及發展前景［J］.林業科學，2005，41(6):151－162.

［7］汪遠征，徐雅靜.SAS軟件與統計應用教程［M］.北京:機械工業出版社，2007:101－146.

［8］黃燕，吳平等.SAS統計分析及應用［M］.北京:機械工業出版社，2005:189－345.

Optimization of extract processing of polyphenol in Sabina Pingiivar.Wilsonii

FU Jin－song，CAI Guang－hua，YANG mei，WANG Xiao－ling*

(Ethnic Pharmaceutical Institute，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China)

Objective:To optimize the condition of extraction for polyphenol in Sabina Pingii var.Wilsonii.Methods:Using reflux extraction method，the influence factors were studied through orthogonal experiment，and then the extraction technologies were optimized through orthogonal regression design.Results:The factors which affected the extraction rate were ethanol concentration＞liquid－solid ratio＞extraction time＞reflux temperature＞marination time＞pH＞extraction times.The optimum conditions were:ethanolconcentration was 81.38%，liquid－solid ratio was 28.89∶1(m L/g)，extraction time was 37.5m in，the extraction could up to 2.789g/100g under the optimum conditions.Conclusion:This extraction method was simple，rap id and applicable for the extraction of total polyphenol in Sabina pingiivar.wilsonii.

Sabina ping iivar.wilsonii;total polyphenol;orthogonal regression design;extraction rate

TS201.1

B

1002－0306(2011)08－0264－03

2010－05－13 *通訊聯系人

伏勁松(1978－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:天然藥物化學。