硅膠柱分離純化發(fā)酵液中葉酸的工藝研究

劉 艷，薛正蓮，胡劉秀，劉杉林，金 花

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241000;

2.蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，安徽蕪湖 241009)

硅膠柱分離純化發(fā)酵液中葉酸的工藝研究

劉 艷1，薛正蓮1，胡劉秀2，劉杉林1，金 花2

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241000;

2.蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，安徽蕪湖 241009)

采用硅膠柱層析法分離純化產(chǎn)朊假絲酵母Y2.12發(fā)酵液，在考察洗脫劑種類(lèi)、洗脫劑配比、上樣液流速以及上樣量這些單因素對(duì)葉酸分離效果的影響的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析找出最優(yōu)工藝參數(shù)。結(jié)果表明:產(chǎn)朊假絲酵母Y2.12發(fā)酵液分離純化得到葉酸的最佳工藝條件為:上樣液流速為1.26mL/min，發(fā)酵液上樣量為5.29mL，洗脫劑乙醇與氨水之比1.84∶1，所提取的葉酸質(zhì)量為(101.12±0.13)μg。

硅膠柱，葉酸，分離，產(chǎn)朊假絲酵母，響應(yīng)面分析

葉酸(Folic acid)屬于B族維生素，對(duì)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)具有十分重要的作用［1－4］。人體缺乏葉酸會(huì)引發(fā)嬰兒的核巨紅細(xì)胞性貧血、孕婦的巨紅細(xì)胞性貧血、新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)異常和老年癡呆癥等疾病［5－8］，因此葉酸具有十分重要的藥用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。由于目前工業(yè)化生產(chǎn)葉酸主要采用化學(xué)合成法，這種方法存在種種弊端，而發(fā)酵法生物合成葉酸存在著明顯的優(yōu)勢(shì)，所以生物法合成葉酸具有十分重要的應(yīng)用前景。本研究中心經(jīng)紫外激光誘變，已篩選出一株產(chǎn)葉酸量高的菌種產(chǎn)朊假絲酵母Y2.12［9］，并對(duì)該菌種的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)高效地分離其有效成分具有十分重要的意義。硅膠其表面含有硅羥基，與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵從而具有吸附性能。從葉酸的分子結(jié)構(gòu)來(lái)看，葉酸為不飽和分子，硅膠對(duì)它的吸附力不是特別強(qiáng)，因此，葉酸吸附在柱上易被洗脫。另外，硅膠是略帶酸性的物質(zhì)，適用于酸性和中性物質(zhì)的分離，葉酸也帶酸性，因此硅膠柱層析法可以很好地用于葉酸的分離純化。SAS(statistical analysis system)統(tǒng)計(jì)軟件，能用少量的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面的研究，取得明顯有效的結(jié)論，避免了有交互作用的多因子實(shí)驗(yàn)可能造成的不可靠結(jié)論［10－13］。本實(shí)驗(yàn)借助響應(yīng)面法對(duì)選育獲得到的產(chǎn)朊假絲酵母Y2.12的發(fā)酵液進(jìn)行分離純化條件優(yōu)化，旨在為生物法合成葉酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯仿，濃鹽酸，葉酸純品 均為分析純;截留分

子量14000的透析袋 北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司;100－200目柱層析硅膠 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;層析柱規(guī)格(內(nèi)徑×長(zhǎng)度) 1.6cm×50cm。HD－21－88核酸蛋白檢測(cè)儀、BSZ－100－LCD 自動(dòng)部分收集器、BT1－100恒流泵 上海琪特分析儀器有限公司;UV－2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津;SW－CJ－CO型雙人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;BS－IE型振蕩培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 經(jīng)激光和紫外復(fù)合誘變過(guò)的產(chǎn)朊假絲酵母Y2.12→菌種活化4d→搖瓶種子培養(yǎng)1d→發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)2d即得

1.2.2 發(fā)酵液預(yù)處理 將發(fā)酵液倒入透析袋中，每隔6h換蒸餾水一次，透析48h。

1.2.3 發(fā)酵液的分離純化

1.2.3.1 硅膠層析柱的填充 將硅膠于濃鹽酸中浸泡24h后，不斷加蒸餾水沖洗直至檢驗(yàn)無(wú)氯離子為止，然后在110℃烘箱中活化2h。活化后的硅膠加氯仿浸泡并攪拌均勻，然后傾入層析柱中，并于上端鋪一層脫脂棉。填充好的層析柱靜置24h后，輕敲柱壁，以除氣泡，再加2倍柱體積淋洗劑走柱子。

1.2.3.2 發(fā)酵液的分離 上樣，移取預(yù)處理過(guò)的發(fā)酵液緩慢滴加到層析柱中進(jìn)行分離純化，使用自動(dòng)部分收集器收集分離液，并用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)分離液進(jìn)行精確測(cè)定并繪制分離圖確定峰高H、峰寬D、峰高峰寬之比R。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 利用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫劑種類(lèi)、洗脫劑配比、上樣液流速、發(fā)酵液上樣量四個(gè)參數(shù)進(jìn)行初步確定，再采用Box－Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)不同參數(shù)組合進(jìn)行優(yōu)化，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表

2 結(jié)果與討論

分離過(guò)程中，通過(guò)比較曲線的峰高峰寬之比R和出峰范圍內(nèi)的葉酸總質(zhì)量M來(lái)綜合評(píng)價(jià)分離條件的優(yōu)劣。

2.1 洗脫劑種類(lèi)的選擇

固定上樣液流速為0.7m L/m in，發(fā)酵液上樣量為5m L，分別用甲醇、乙醇兩種洗脫劑對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離，確定最佳洗脫劑的種類(lèi)，所得結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同種類(lèi)洗脫劑對(duì)洗脫效果的影響

由表2可以看出，洗脫劑選用甲醇和乙醇的分離效果差距不大。但由于甲醇比乙醇更易揮發(fā)，并有較強(qiáng)的毒性，不利于分離食用葉酸，由此洗脫劑種類(lèi)選用乙醇。

2.2 洗脫劑配比的確定

固定上樣液流速為0.7m L/m in，發(fā)酵液上樣量固定為5m L，分別用乙醇和氨水不同配比的洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析分離實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 不同洗脫劑配比對(duì)洗脫效果的影響

由表3可知，洗脫劑中乙醇與氨水的比例為3∶1時(shí)，雖然峰寬D較大，但曲線峰高H、葉酸質(zhì)量M均為最大，且與其余二組數(shù)據(jù)差距較大，分離純化得到的葉酸多，所以洗脫劑配比初步確定為乙醇∶氨水=3∶1。

2.3 洗脫劑流速的確定

固定發(fā)酵液上樣量為5m L，洗脫劑乙醇與氨水的比例為3∶1，調(diào)節(jié)不同上樣液流速進(jìn)行分離，所得結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同上樣液流速對(duì)洗脫效果的影響

由表4可以看出，流速為1.2m L/min時(shí)，曲線峰高H，峰高與峰寬比值R均為最大，葉酸質(zhì)量M與流速為0.5m L/min或0.7m L/min時(shí)相差不大，起峰快且高，基本無(wú)拖尾現(xiàn)象，所以流速初步確定為1.2m L/min。

2.4 發(fā)酵液上樣量的確定

固定洗脫劑乙醇與氨水的比例為3∶1，上樣液流速為0.7m L/m in，調(diào)節(jié)不同發(fā)酵液上樣量進(jìn)行分離，所得結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同發(fā)酵液上樣量對(duì)洗脫效果的影響

由表5可知，發(fā)酵液上樣量為4m L時(shí)，峰高H和葉酸質(zhì)量M僅低于5m L時(shí)的曲線，且曲線R值最大，無(wú)拖尾現(xiàn)象。而上樣量為5mL時(shí)R值太小，拖尾現(xiàn)象明顯，分離效果不佳，所以發(fā)酵液上樣量選用4m L。

2.5 Box－Behnken響應(yīng)面分析

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以葉酸濃度為響應(yīng)值，采用三因素三水平的Box－Behnken響應(yīng)面分析法，其中包括12個(gè)析因點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，3個(gè)零點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

2.5.2 二次響應(yīng)面回歸模型的建立 以葉酸濃度為響應(yīng)值，根據(jù)表6中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SAS V8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表6中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立以葉酸質(zhì)量M為響應(yīng)值的全變量二次回歸方程，并進(jìn)一步通過(guò)數(shù)據(jù)優(yōu)化程序求得當(dāng)響應(yīng)面值最大時(shí)的各參數(shù)最優(yōu)水平，所得方程如下:

表7 方差分析結(jié)果

表6 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

方程回歸分析及方差分析見(jiàn)表7，響應(yīng)面圖見(jiàn)圖1。由表7可知，回歸模型極顯著(Pmodel＜0.01)，失擬項(xiàng)在а=0.05水平上不顯著(P=0.121579＞0.05)，其決定系數(shù)R2=0.9854，表明該模型擬合程度良好，可以用于葉酸發(fā)酵液分離工藝優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)。

從表 7 還可以看出 X1，X2，X3，X1X1，X2X2和X3X3為極顯著因素。由響應(yīng)面立體分析圖可知，Y在一定三維變量區(qū)域內(nèi)響應(yīng)值Y存在最優(yōu)值。通過(guò)回歸方程可得知 X1、X2、X3優(yōu)化后的確切值，X1=－0.26072，X2=0.32280，X3= －0.38581，此時(shí)可使得回歸方程Y取得最大值:99.43905。由此可知，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化后硅膠柱層析分離中的各參數(shù)為:上樣液流速 =1.26072m L/m in，發(fā)酵液上樣量 =5.2912m L，洗脫劑配比 =1.84257∶1。結(jié)合儀器的可操作性，優(yōu)化條件為上樣液流速為1.26m L/min，發(fā)酵液上樣量為 5.29m L，洗脫劑乙醇與氨水之比 =1.84∶1。

圖 1 Y=f(X1，X2)，Y=f(X1，X3)，Y=f(X2，X3)響應(yīng)面立體分析圖

2.5.3 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果，用以上得到的最優(yōu)組合重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，葉酸產(chǎn)量為(101.12±0.13)μg，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間良好的擬合性證實(shí)了該模型的有效性。并且峰高與峰寬比R較大，拖尾現(xiàn)象不明顯，所以該工藝參數(shù)可以很好地用于發(fā)酵液中葉酸的分離。

3 結(jié)論

硅膠柱法分離純化葉酸發(fā)酵液的最優(yōu)條件為:上樣液流速為1.26m L/m in，發(fā)酵液上樣量為5.29m L，洗脫劑乙醇∶氨水 =1.84∶1，所提取的葉酸質(zhì)量為(101.12 ±0.13)μg。

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Study on separation and purification of folic acid from fermented broth by silica gel column chromatography

LIU Yan1，XUE Zheng－lian1，HU Liu－xiu2，LIU Shan－lin1，JIN Hua2

(1.College of Biochemistry Engineering，Anhui Polytechnic University，Microorganism Fermentation Engineering and Technology Research Center of Anhui Province，Wuhu 241000，China;
2.Wuhu Zhang Heng Chun Medicine CO.，LTD.，Wuhu 241009，China)

Fermented broth of Candida utilis Y2.12 was separated and purified by silica gel column chromatography.The elution effects with different kinds of eluents，proportion of twoeluents，flow rate and loading amount were studied.Based on single factor experiments，the proportion of ethanol and ammonia，flow rate，loading amount were analyzed by response surface methodology.The results showed that the optimal separation technological parameters were as follows:1.26m L/m in flow rate，5.29m L loading amount，1.84∶1 the proportion of ethanol and ammonia.The weight of extracted folic acid was(101.12 ±0.13)μg.

silica gel column;folic acid;separation;Candida utilis;response surface methodology

TS201.1

B

1002－0306(2011)08－0304－04

2010－08－05

劉艷(1981－)，女，講師，研究方向:食品加工。

國(guó)家教外司留(［2001］660);蕪湖市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008507);安徽工程大學(xué)重點(diǎn)青年基金項(xiàng)目(2007YQ006zd)。