一種新型培養(yǎng)基在沙門氏菌檢測中的效果評價

范媛媛，鄭 冰，王樹祥，楊公明

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642;2.順德出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東順德 528303)

一種新型培養(yǎng)基在沙門氏菌檢測中的效果評價

范媛媛1，2，鄭 冰2，王樹祥2，楊公明1，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642;2.順德出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東順德 528303)

目的:評價一種新型的SX2液體培養(yǎng)基對沙門氏菌的增菌效果。方法:對目標(biāo)菌株的靈敏度、生長率、選擇性及生化反應(yīng)等幾個方面進(jìn)行測試，根據(jù)測試結(jié)果來判斷新型培養(yǎng)基的增菌效果。結(jié)果:新型培養(yǎng)基與國標(biāo)推薦方法中使用的培養(yǎng)基的增菌效果相當(dāng)。結(jié)論:此液體培養(yǎng)基可以作為沙門氏菌的快速檢測用增菌液。

沙門氏菌，培養(yǎng)基，檢測

沙門氏菌是人和動物的重要致病菌，是引起食物中毒的主要病原菌之一［1］，沙門氏菌作為食源性感染致病菌目前在世界各國還排列在細(xì)菌食物中毒的首位［2］。世界衛(wèi)生組織十分明確地規(guī)定了沙門菌屬于食品衛(wèi)生必檢項(xiàng)目之一。食品原料、飼料的運(yùn)輸、加工生產(chǎn)過程都會因引進(jìn)沙門氏菌而造成污染，沙門氏菌的污染已對食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［3］。因此準(zhǔn)確地檢測食品及飼料中沙門氏菌，對預(yù)防疾病、提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量，保護(hù)人類身體健康都具有十分重要的意義。食品中沙門氏菌的國家檢測標(biāo)準(zhǔn)已沿用多年，但由于其操作繁瑣、工作量大、耗時過長等不足，無法滿足快速檢測的需要。因此，研究者對傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法和檢測方法中的培養(yǎng)基都進(jìn)行了不斷改進(jìn)，以期得到快速可靠的檢測方法。AFNOR改良法是法國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會新推出的一種檢測方法，此檢測方法中采用了新型的SX2液體培養(yǎng)基。SX2液體培養(yǎng)基是在傳統(tǒng)方法前增菌的基礎(chǔ)上，改變了選擇性增菌所使用的培養(yǎng)基，由新型的液體培養(yǎng)基SX2取代了國標(biāo)中的SC、TTB液體培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)的溫度和時間也與國標(biāo)法不同，分別為41.5℃，培養(yǎng)22～26h。文中針對SX2液體培養(yǎng)基對沙門氏菌的增菌效果進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鼠傷寒沙門氏菌CMCC(B)50115、大腸埃希氏菌ATCC25922 BPW、SC增菌液 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;VIDAS SLM篩檢條、API 20E、SX2增菌液、RVS增菌液 法國Bio Mérieux公司;BS瓊脂、XLD瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基TSA 北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 使用GB4789.4與AFNOR改良法分別進(jìn)行增菌實(shí)驗(yàn)［4］，國標(biāo)法中使用的培養(yǎng)基SC為《培養(yǎng)基制備指南》［5］的第二部分中推薦使用的參考培養(yǎng)基，其培養(yǎng)條件為37℃，24h;而AFNOR改良法使用的SX2培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為41.5℃，22～26h。對比兩種方法的增菌效果。為更好地驗(yàn)證SX2的增菌效果，還選擇了另外一種參考培養(yǎng)基RVS，此培養(yǎng)基在一些國外標(biāo)準(zhǔn)中也經(jīng)常使用，其培養(yǎng)條件為41.5℃，24h。

1.2.2 菌懸液的制備［5－6］分別取鼠傷寒沙門氏菌和大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的營養(yǎng)瓊脂新鮮培養(yǎng)物少許，于無菌的生理鹽水中，制成一定濃度的菌懸液。

鼠傷寒沙門氏菌的菌懸液用無菌生理鹽水依次從10－1到10－10作連續(xù)10倍遞減稀釋液，備用。同時取1m L 10－10稀釋度的菌懸液涂布平板，做兩個平行樣，分別菌落計(jì)數(shù)，取平均值為85cfu。大腸埃希氏菌的菌懸液稀釋后，測量其濃度為8.0×104cfu/m L。

1.2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn) 接種時，取10－5～10－9稀釋液各0.1m L分別加入SC、RVS、SX2液體培養(yǎng)基中，每一稀釋度接種3管，按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求的條件培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。三分之二或以上管數(shù)呈現(xiàn)生長(混濁)的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度［7］。

1.2.4 生長率實(shí)驗(yàn) 采用定量的方法評價培養(yǎng)基的微生物學(xué)性能。取0.1m L的1.2.2中稀釋度為10－9的鼠傷寒沙門氏菌的菌懸液，接種于SC、SX2液體培養(yǎng)基中;取0.1m L的1.2.2中的大腸埃希氏菌的稀釋菌懸液接種于SC、SX2液體培養(yǎng)基中;再取上述的兩種菌懸液各0.1m L混合后接種于SC、SX2液體培養(yǎng)基中，每步接種都分別做兩個平行樣。經(jīng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求的條件培養(yǎng)后，取1m L接種了非目標(biāo)菌的培養(yǎng)液涂布于TSA平板，計(jì)數(shù)菌落總數(shù);再取1m L接種了目標(biāo)菌的培養(yǎng)液、1m L接種了目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的混合菌培養(yǎng)液的 10－7、10－8、10－9稀釋液，分別涂布接種于TSA平板，選擇適合計(jì)數(shù)的平板，計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。

生長率PR的計(jì)算公式如下:

式中，PR:生長率(回收率);NS:從一個或多個待測培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù);N0:從一個或多個規(guī)定的參考培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)(該菌落總數(shù)應(yīng)≥100cfu)。

參照ISO等標(biāo)準(zhǔn)，非選擇培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率不得低于0.7;選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率最低應(yīng)為 0.1，非目標(biāo)菌的 SF值至少應(yīng)達(dá)到 2［5－6，8］。

1.2.5 選擇性實(shí)驗(yàn) 采用半定量的方法測試SX2的選擇性。取1m L的1.2.2中制備的大腸埃希氏菌菌懸液加入SX2肉湯中，接種三個平行樣，按相關(guān)條件培養(yǎng)。用3mm接種環(huán)取培養(yǎng)物劃平行直線接種于TSA平板，培養(yǎng)后觀察非目標(biāo)菌的生長情況，根據(jù)非目標(biāo)菌的生長情況進(jìn)行評價:非選擇性平板上沒有菌落生長或少于10cfu，則表示液體測試肉湯的選擇性良好。

1.2.6 生化特性測試 選取1.2.4生長率實(shí)驗(yàn)中，混合菌用SX2增菌后，在平板TSA上得到的典型菌落，采用API 20E進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鼠傷寒沙門氏菌在SC、RVS、SX2液體培養(yǎng)基中的生長情況見表1。

表1 鼠傷寒沙門氏菌在三種液體培養(yǎng)基中的生長情況

從表1可知，SX2和SC、RVS增菌液的靈敏度均可達(dá)到10－9，因此可以判斷，在檢測沙門氏菌時，SX2增菌液的靈敏度與SC、RVS增菌液的靈敏度相當(dāng)。

2.2 生長率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別計(jì)數(shù)各TSA平板后，鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌在SC、SX2液體培養(yǎng)基中的生長情況見表2。

表2 工作菌株在液體培養(yǎng)基中的生長情況

由表2可見，鼠傷寒沙門氏菌在SX2增菌液中的生長率為0.94，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.1;而非目標(biāo)菌大腸埃希氏菌的最高濃度為3cfu/m L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)要求的濃度104cfu/m L;在混合菌中目標(biāo)菌的生長未受到非目標(biāo)菌的抑制，始終為優(yōu)勢菌，其最低濃度為 2.5×108cfu/m L，大于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最低濃度106cfu/m L。以上各項(xiàng)指標(biāo)表明此培養(yǎng)基對目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的培養(yǎng)均符合ISO等培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2.3 選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三個TSA平板中，兩個平板上無菌落生長，只有一個平板上的大腸埃希氏菌菌落為1cfu，小于標(biāo)準(zhǔn)要求的10cfu，則結(jié)果表示，液體測試肉湯SX2的選擇性良好。

2.4 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

挑取1.2.4中TSA平板上的菌落進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)菌株為鼠傷寒沙門氏菌，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相符。

3 結(jié)論與討論

通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，新型的液體培養(yǎng)基SX2能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求，可以作為實(shí)驗(yàn)室檢測沙門氏菌用培養(yǎng)基，并且其檢測方法與傳統(tǒng)方法相比簡便、省時，從前增菌到上機(jī)，只需要48h，如果結(jié)果是陰性，最多耗時49h就可以出報告，而且不需要劃平板、觀察菌落形態(tài)特征;而傳統(tǒng)的方法，得到陰性結(jié)果也要3d。

面對目前進(jìn)出口貿(mào)易頻繁，檢測任務(wù)逐漸加重的現(xiàn)狀，簡便省時快速的檢測方法日益受到檢測機(jī)構(gòu)的青睞。那么如何改進(jìn)方法，提高檢測效率，就要求從最基本的培養(yǎng)基做起，選擇一種適合的培養(yǎng)基，既能快速促進(jìn)目標(biāo)菌的生長，又能明顯抑制非目標(biāo)菌的生長。很多國家和機(jī)構(gòu)一直在對培養(yǎng)基的性能進(jìn)行改進(jìn)。

本文所使用的SX2液體培養(yǎng)基就是法國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會新推出的一種沙門氏菌檢測方法——AFNOR改良法中所使用的培養(yǎng)基，此AFNOR改良法是法國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會在雙線增菌法、單線增菌法基礎(chǔ)之上建立起來的新方法，與其他方法的明顯改進(jìn)就是使用了SX2新型培養(yǎng)基。自1994年4月確認(rèn)了VIDAS SLM沙門氏菌測試可作用所有人和動物食品的沙門氏菌快速測試方法后［9］，被一些國家陸續(xù)采用，1996年5月被AOAC采用［10］，丹麥獸醫(yī)與食品管理局、加拿大公共衛(wèi)生部、英國、德國也把VIDAS SLM測試作為標(biāo)準(zhǔn)方法;而我國檢測細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)方法還是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，所以我們可以借鑒一些國外方法，提高檢測效率，或者將國內(nèi)和國外的方法相結(jié)合，但陽性結(jié)果的樣品必須按國標(biāo)方法做證實(shí)實(shí)驗(yàn)方可報告結(jié)果。

［1］賀連華，吳平芳，劉濤.食品中沙門菌檢驗(yàn)方法的優(yōu)化與應(yīng)用［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15(5):1575－1576.

［2］Cheng CM，Lin W，Van KT，et al.Rapid detection of Salmonella in foods using real－time PCR［J］.Food Prot，2008，71(12):2436－2441.

［3］王耀，鄭秋月，曹際娟.SYBRTMR Green Ⅰ實(shí)時PCR快速檢測沙門氏菌［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18(4):314－317.［4］吉林省疾病預(yù)防控制中心，河南省疾病預(yù)防控制中心，廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，等.GB 4789.4－2008，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門菌檢驗(yàn)［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008:1－6.

［5］SN/T 1538.2－2007.培養(yǎng)基制備指南［S］.第 2 部分:培養(yǎng)基性能測試使用指南.

［6］SN/T 1538.1－2005.培養(yǎng)基制備指南［S］.第 1 部分:實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則.

［7］中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會.中國生物制品規(guī)程(2000年版)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［8］ISO/TS 11133－2:2003.Microbiology of food and animal feeding stuffs－Guidelines on preparation and production of culture media［S］.Part 2:Practical guideline on performance testing of culturemedia.

［9］Norme ISO6579，Directivesge neralesco ncemant les methodesde re cherchb des Sa lmonella，AFNOR［S］.December，1993，5.

［10］CURIALE，et al.Journal of AOAC［J］.1997，80:469－504.

Application of a new culture media in Salmonella examination

FAN Yuan－yuan1，2，ZHENG Bing2，WANG Shu－xiang2，YANG Gong－m ing1，*
(1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;
2.Entry－exit Inspection and Quarantine Bureau，Shunde 528303，China)

The effectiveness of a new liquid culture media SX2for Salmonella was evaluated.Several aspects，such as sensitivity，productivity，selectivity and biochemicalevents were tested，according to the test results to evaluate the effectiveness.The effectiveness of new liquid culture media was correspondent with routine.Finally，the new liquid culture media may be used as culture media for Salmonella rapid detection.

Salmonella;culture;detection

TS207.4

A

1002－0306(2011)08－0415－03

2010－07－30 *通訊聯(lián)系人

范媛媛(1977－)，女，在讀博士研究生，工程師，研究方向:食品質(zhì)量與安全。