微射流均質結合非淀粉酶處理法對大米蛋白-淀粉復合體分離效果的研究

龔 倩，楊曉泉，*，夏 寧，萬 娟，陳嘉東

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640;

2.廣東省糧食科學研究所，廣東廣州 510050)

微射流均質結合非淀粉酶處理法對大米蛋白-淀粉復合體分離效果的研究

龔 倩1，楊曉泉1，*，夏 寧1，萬 娟2，陳嘉東2

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640;

2.廣東省糧食科學研究所，廣東廣州 510050)

采用微射流處理結合非淀粉酶處理對碎米中蛋白質－淀粉復合物進行解聚處理，并研究所獲得蛋白質及淀粉產品的性質。結果表明:此方法能夠有效分離碎米中蛋白質及淀粉;獲得的蛋白質與堿法提取的蛋白質相比，更具天然性;淀粉產品比堿法提取的淀粉有更低的峰值溫度及更高的峰值粘度。由此可見，微射流結合非淀粉酶處理是高效分離碎米中蛋白質及淀粉，并獲得高品質產品的一種有效途徑。

微射流均質，碎米，蛋白質，淀粉

碎米是大米加工中不可避免的副產物，但目前并未得到合理有效的利用。碎米的主要成分是80%左右的淀粉及8%左右的蛋白質［1］，與整米無異，但售價低廉，是用于提取大米蛋白及淀粉的優質原料。大米胚乳內部結構緊密，淀粉顆粒細小，并且幾乎全部以復粒形式存在;蛋白質以兩種蛋白體形式存在，即PB－I和PB－II兩種類型，并且與淀粉顆粒包絡緊密［2］。胚乳中超過80%的蛋白質是谷蛋白，分子內和分子之間廣泛存在的二硫鍵以及分子內存在的巰基，決定其不溶于中性鹽溶液而只溶于稀酸、稀堿，給大米蛋白的分離也帶來困難［3］。目前常用的方法有堿浸法［4－5］、溶劑法［6］及酶法［7］。其中，在高堿的條件下，蛋白質會發生一系列的不良反應而產生有毒物質，產品不適合人類食用，只能用作動物飼料;溶劑法可能導致萃取溶劑在產品中的殘留，存在食品安全隱患;而蛋白酶的處理，通常會導致苦味肽的生成，產品風味不佳;淀粉酶處理則破壞其中的淀粉，不能同時獲得淀粉產品。Guraya等人報道利用微射流均質的方法破壞淀粉－蛋白質復合體，高效的同時獲得兩種產品，但存在的主要問題是蛋白質產品的純度不高［8］。本課題的研究目的在于采取微射流均質法，并在非淀粉酶的輔助作用下，解聚碎米中淀粉－蛋白質復合體，使蛋白質與淀粉組分發生分離，并通過進一步的分離純化，得到高純度的蛋白質產品及低蛋白質殘留的淀粉產品。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

碎米 廣東省糧食科學研究所提供，粉碎60目備用，蛋白質含量7.12%;果膠酶、纖維素酶、戊聚糖酶、α－淀粉酶、糖化酶 丹麥諾維信公司;其他試劑 均為分析純。

中試型膠體磨 德國IKA公司;M2110EH微射流納米均質機 美國Microfluidics公司;CR22G冷凍離心機 日本Hitachi公司;Rapid N Cube快速定氮儀 德國Elementar公司;Q100差示掃描量熱儀 美國TA Instruments公司;Mastersize2000粒度分布儀英國Malvern公司;布拉班德粘度儀 德國Brabender公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿浸法分離 在室溫下將碎米粉浸泡在0.1%的NaOH溶液中，放置18h。離心處理，結束后收集沉淀為大米淀粉，烘干備用，并用1mol/L的HCl溶液沉降上清液中蛋白質，凍干備用。

1.2.2 微射流均質結合酶處理法分離 室溫下將碎米粉浸沒于一定比例的去離子水中浸泡30m in，后倒入膠體磨進一步濕法磨漿至120目。將米漿倒入微射流均質機的進料筒內，均質一定次數后，收集碎米乳液，向其中添加果膠酶、纖維素酶、戊聚糖酶等，反應一定時間后，調節pH至10.0滅酶。將米乳液離心處理，結束后收集上清液、中間層及沉淀層，用于下一步實驗。利用α－淀粉酶及糖化酶對中間層處理，獲得純度較高的大米蛋白。

1.2.3 蛋白質含量及分布測定 本實驗中蛋白質含量的測定均采用GB5009.5－2010燃燒法，大米蛋白的蛋白因子為 5.95［8］。

1.2.4 蛋白質熱性質分析 稱取2.0mg蛋白樣品于鋁盒，吸取10μL去離子水浸潤樣品，壓盤。以空白盤做對照，溫度掃描范圍:25～95℃;升溫速率:10℃/m in;保護氣氮氣流速:50m L/m in。采用 The Universal Analyzer 2000軟件計算蛋白質的變性起始溫度(Tm)、變性溫度(Td)、半峰寬(ΔT1/2)和變性焓變(ΔH)。

1.2.5 粒徑分布 將100mg待測樣品溶解于5m L去離子水中，振蕩10m in使樣品顆粒分散均勻。采用Mastersizer2000粒徑分布儀測定。按照儀器提示加入所需量的樣品數滴，樣品加入后在儀器中進行分散，分散劑為水，在轉速為1800 r/m in的條件下測定，得粒徑體積分布圖。

1.2.6 布拉班德粘度曲線分析 準確配制6.0%淀粉糊(以干基計)，倒入布拉班德粘度測定儀專用的圓筒形鋁盒中。測定條件:從30℃開始計時，以1.5℃/min的速度上升到95℃;95℃下保持30m in;以1.5℃/m in下降到50℃;50℃下保持30m in。糊化過程中攪拌器的速度保持在160 r/min。

2 結果與討論

2.1 微射流均質處理對碎米蛋白在不同組分中的分布及含量的影響

微射流高壓均質可以破碎碎米胚乳細胞壁，使細胞破碎，且使碎米胚乳中緊密結合的蛋白質－淀粉復合體發生松團作用，使蛋白質游離而與淀粉分離。繼而通過離心分級，可使具有不同密度的樣品逐步分離，富集于不同的組分中。其中，受限于碎米蛋白的較差的溶解性，僅極少量的蛋白質溶解于上清液中;游離出的蛋白質組分主要富集在中間層;淀粉組分及未發生分離或部分分離的蛋白質－淀粉復合體主要集中在殘渣層。

本實驗中，不同程度的均質處理工藝對各組分中蛋白質分布的影響如圖1所示。其結果表明，作為對照的未處理的樣品經過離心后，蛋白質主要集中在沉淀層中(回收率高達92.18%)，而上清液及中間層的蛋白質分布很少，并且沉淀層中的蛋白質含量(7.12%)與原料相比幾乎沒有改變，由此可見樣品中幾乎未發生蛋白質與淀粉組分的分離。經過膠體磨處理后，上清液和中間層的蛋白質分布明顯增多，蛋白質集中于中間層(回收率63.79%)，且沉淀層的殘余蛋白含量降低至2.32%，由此可見該處理能促進碎米中蛋白質的游離，并使蛋白質富集于中間層。進一步的高壓均質處理對蛋白質在不同組分中的分布也有重要影響:隨著均質次數的增多，上清液中蛋白質含量及回收率呈現出先降低后升高的趨勢;在中間層，蛋白純度隨均質次數增多而增大，而回收率呈現先升高后降低;沉淀層中，蛋白質純度及回收率呈先降低后升高的趨勢。由此可見，高壓均質能有效促進蛋白質與淀粉的分離，但過多的均質次數，能使部分蛋白質重新復合而沉降，導致分離效果的弱化。尤其是微射流均質2次處理后，中間層的蛋白回收率(72.89%)最高，且殘渣層殘余蛋白含量(1.29%)最低。據此認為，微射流均質2次處理對碎米蛋白－淀粉復合體的分離效果最好。

圖1 微射流均質處理對碎米蛋白在不同組分中的分布的影響

2.2 不同微射流均質處理程度對淀粉粒徑的影響

碎米淀粉顆粒的粒徑較小，均值為2～8μm，絕大多數在10μm以內;而未與蛋白質完全分離的蛋白－淀粉復合體則呈現出更大的粒徑值。因此，可以用淀粉的粒徑分布來衡量不同處理方法對碎米淀粉及蛋白質的分離程度。圖2為不同微射流均質程度的淀粉樣品的粒徑分布曲線，結果表明，未處理樣品的粒徑分布主要集中在100～200μm范圍內，而在10μm附近處有一個更微弱的峰，說明未處理的樣品只有極少部分發生了淀粉－蛋白質復合體的解聚;膠體磨處理后，顆粒粒徑分布前移，更多的集中在10～20μm處，且在100～200μm范圍的分布減少;微射流均質處理后，粒徑分布繼續前移，第一個峰值出現在10μm，同時在100～200μm處仍存在明顯峰形。這表明，均質處理后，碎米淀粉易于離散，但仍有部分淀粉顆粒以復粒或淀粉－蛋白復合體的形態存在。

圖2 不同微射流均質處理的淀粉樣品的粒徑分布曲線

2.3 微射流均質結合酶法處理對蛋白質分布及含量的影響

在本實驗中，選取微射流均質2次為均質處理分離碎米蛋白的最佳條件。在此基礎上，研究結合果膠酶、纖維素酶、戊聚糖酶等單一酶處理及三種酶共混使用對其分離效果的影響。圖3為微射流均質結合酶法處理后各組分中的蛋白質分布及含量，以未處理樣品做為對照。研究結果表明，在微射流均質2次的基礎上，使用酶處理可以進一步強化分離效果:相較于對照樣，在蛋白質富集的中間層中，蛋白質的回收率有很大的提高，尤其是三種酶制劑復合使用時，回收率從5.03% 提升至81.87%，蛋白質純度45.00%;在淀粉富集的殘渣層中，蛋白質含量均得到不同程度的降低，戊聚糖酶的添加使殘渣層蛋白含量降低至0.96%，使用復合酶后殘渣層中蛋白質含量為1.10%。

圖3 酶法輔助微射流均質處理對蛋白質分布的影響

綜合上述結果，本實驗選取微射流均質2次結合復合酶制劑所得樣品進行下一步研究。定義其殘渣層為均質法－淀粉，其殘余蛋白含量1.10%，略低于堿法－淀粉(殘余蛋白含量2.04%);并利用α－淀粉酶與淀粉糖化酶共同處理去除中間層的淀粉雜質，獲得進一步純化的蛋白樣品(純度87.89%)，定義為均質法－蛋白，其蛋白質純度略高于堿法－蛋白(純度81.12%)。

2.4 蛋白質熱性質分析

利用差示掃描量熱儀測定堿法－蛋白與均質法－蛋白的熱學特性，其掃描曲線如圖4所示。均質法－蛋白樣品的DSC譜圖呈現出一個單一的吸熱峰(Td=66.46℃)，這歸結于均質法－蛋白樣品的變性;而堿法－蛋白樣品的DSC曲線上沒有明顯的吸熱峰，反而呈現為平直曲線。這表明，經過堿液浸泡處理所提取的蛋白質發生變性，未能出現米蛋白的特征峰。即相較于堿法－蛋白樣品，均質法－蛋白樣品更接近天然蛋白。

圖4 碎米蛋白的DSC掃描曲線

2.5 布拉班德粘度曲線

布拉班德粘度儀可用于評價淀粉的糊化性質:淀粉乳在升溫過程中，顆粒緩慢膨脹。當達到淀粉的糊化溫度時，淀粉便大量吸收水分而溶脹成淀粉糊，使體系的粘度快速增大。繼續保溫、降溫、保溫，淀粉糊粘度會隨之發生一系列變化。堿法－淀粉及均質法－淀粉的布拉班德粘度曲線如圖5所示。實驗結果表明，與堿法－淀粉樣品相比，均質法－淀粉具有更低的起始糊化溫度，更早到達峰值溫度，且具有更高的峰值粘度，這與均質法破壞了淀粉顆粒與蛋白體的結合有關，使得均質法－淀粉更易吸水膨脹;此外均質法－淀粉的最終粘度顯著高于堿法－淀粉，這是由于前者樣品中殘余的蛋白質含量更低。

圖5 堿法－淀粉及均質法－淀粉樣品的布拉班德粘度曲線

3 結論

利用微射流均質可以有效地破壞碎米中淀粉－蛋白質復合體，達到二者的有效分離;輔助以果膠酶、纖維素酶、戊聚糖酶等后，分離效果更佳，在中間層的蛋白回收率高達81.87%，獲得淀粉樣品的蛋白質殘余僅為1.10%。淀粉粒度分布的分析表明，微射流均質處理能導致解聚淀粉－蛋白質復合體，獲得微細化的大米淀粉顆粒，且使碎米中蛋白質及淀粉易于分離。此外，對堿法及均質法樣品進行對比分析，DSC的分析結果表明與堿法－蛋白相比，均質法－蛋白的熱性質及結構更接近天然碎米蛋白;布拉班德粘度曲線結果表明與堿法－淀粉相比，均質法－淀粉具有更低的起始糊化溫度，更早到達峰值溫度，且具有更高的峰值粘度及最終粘度。由此可見，微射流結合非淀粉酶處理是高效分離碎米中蛋白質及淀粉，并獲得高品質產品的一種有效途徑。

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Study on separation of rice protein－starch aggregates by microfluidization homogenization combined with non－amplyse carbohydrases

GONG Qian1，YANG Xiao－quan1，*，XIA Ning1，WAN Juan2，CHEN Jia－dong2

(1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China;2.Guangdong Institute of Cereal Science Research，Guangzhou 510050，China)

Microfluid ization homogenization assisted with none－amylase carbohydrases treatment were used to wreck starch－protein aggregates in broken rice，then the samples were analyzed.The results showed that:the method was effective in separating protein and starch in broken rice，meanwhile，compared with alkali method，the protein extracted was more native，and starch extracted owns lower beginning of gelatinization temperature，higher viscosity values.Hence，microfluidization homogenization assisted with none－amylase carbohydrases treatment was considered as a kind of method，which separated protein and starch effectively in broken rice，with attaining high quality samples.

microfluidization homogenization;broken rice;protein;starch

TS210.1

A

1002－0306(2011)07－0119－04

2010－07－19 *通訊聯系人

龔倩(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:植物蛋白質工程。

廣東省重大科技專項產業共性技術項目(2009A080209001)。