產β-半乳糖苷酶的節桿菌誘變選育及培養基優化

唐 蕾，董曉璇，李珍愛，孫慧慧，楊瑞金，毛忠貴，*

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122;

2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

產β-半乳糖苷酶的節桿菌誘變選育及培養基優化

唐 蕾1，董曉璇1，李珍愛1，孫慧慧1，楊瑞金2，毛忠貴1，*

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122;

2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

酶法合成乳果糖需要使用同時具備水解和轉苷活力的β－半乳糖苷酶為催化劑。采用物理誘變，培養基優化手段，以提高細菌產該類β－半乳糖苷酶的能力為目的，自然篩選獲得的具有轉苷能力的節桿菌Arthrobacter sp.，經紫外線照射處理，采用5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X－gal)為平板篩選顯色劑，加之搖瓶發酵篩選，得到8株產酶水平明顯提高的誘變株，其中Arthrobacter sp.M2酶活力較野生株提高了89%，傳代5次酶活基本穩定。采用正交實驗優化產酶培養基，結果表明:在乳糖濃度為10g/L，玉米漿濃度為22g/L，Fe3+濃度為1.5mmol/L時效果最佳，酶活水平進一步提高了113%。紫外誘變和培養基優化有效地提高了節桿菌產β－半乳糖苷酶的水平。

節桿菌，紫外誘變，β－半乳糖苷酶

乳果糖是由半乳糖和果糖以β－1，4－糖苷鍵結合而成的二糖，它可以促進雙歧桿菌增殖，具有調整腸道菌群平衡，治療肝性腦病、降低內毒素、預防結腸息肉術后復發等功效，因而已被很多國家應用于藥物和功能性食品中［1－3］。目前乳果糖的生產有化學合成與生物轉化兩種。化學合成主要是用堿液處理將乳糖異構化，其缺點在于生產過程中產生的有色副產物難以去除，造成分離純化成本高，而且堿液對乳果糖的降解降低了產量［4－6］。生物轉化法利用全細胞或者純化的酶，催化底物乳糖和果糖合成乳果糖，目前使用的商用乳果糖合成酶主要是來自乳酸克魯維酵母的β－半乳糖苷酶，但在用該酶合成乳果糖的過程中夾雜了其他低聚糖的生成［7］。本實驗室曾報道了從自然分離得到的節桿菌Athrobacter sp.具有專一合成乳果糖的能力［8］，但是作為原始出發菌株，酶活水平較低，需要進行改造，并配合適宜的產酶條件，以提高產酶量。為此本文采用紫外誘變處理，篩選酶活性提高的突變株，并通過培養基優化，進一步提高產酶水平。

表2 正突變菌株的β－半乳糖苷酶活水平及酶活提高率

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節桿菌Arthrobacter sp. 由本實驗室篩選得到;固體培養基(g/L) NaCl 5、酵母膏5、蛋白胨10、瓊脂20;液體培養基(g/L) 乳糖20、酵母膏5、蛋白胨10;篩選培養基(g/L) 乳糖20、酵母膏5、蛋白胨10、X－gal 0.3、瓊脂20;酵母膏、蛋白胨 國藥集團化學試劑有限公司，生物試劑;鄰硝基苯－β－D－半乳糖苷(ONPG)、X－gal 上海生物工程有限公司，分析純。

超聲破碎儀 Ultrasonic Processor，美國;Unico UV－2100紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TGL－16G臺式高速離心機 上海安亭科學儀器廠;旋轉式恒溫搖瓶柜 上海蘇坤實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 β－半乳糖苷酶酶活測定 將固體培養基上的Arthrobacter sp.接種于液體培養基中，30℃、200 r/m in振蕩培養18h，離心收集菌體，菌體重懸于50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，超聲破碎、離心制成粗酶液。在試管中加入 2.5m L、100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)，37℃恒溫水浴預熱后，加入粗酶液和ONPG，37℃反應10m in，加入 1mol/L Na2CO3溶液終止反應，測定420nm處的吸光值。采用國際酶活單位，規定1min催化ONPG水解生成1μmoL鄰硝基酚的酶量為一個酶活單位(U)。

1.2.2 紫外誘變方法 將生長至對數期的菌液，離心收集菌體，加入無菌生理鹽水離心洗滌2次后，轉入裝有滅菌玻璃珠的三角瓶內振蕩，打散菌體，并調整細胞濃度至108/m L。取5m L菌液加到直徑9cm的培養皿內，置于15W紫外燈下，距離30cm，分別照射 30、60、90、120、150s，取未照射的菌液和照射的菌液各0.5m L進行梯度稀釋，涂布于固體培養基上，30℃避光培養72h，計算致死率。選擇致死率為70%的照射時間進行紫外照射，取照射后的菌液2m L置于液體培養基中(250m L搖瓶，裝液量為25m L)，30℃下120 r/m in振蕩培養5h，稀釋涂布于篩選培養基上，30℃避光培養72h，挑選深藍色的菌落，搖瓶培養，測定酶活水平。

1.2.3 正交實驗 選擇影響產酶的4個主要因素(表1)，根據L9(34)正交實驗因素水平表配制9種液體培養基，接種，30℃下200 r/m in振蕩培養18h，測定酶活。

表1 正交實驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 紫外照射致死率

由圖1可知，隨著紫外照射時間的延長，致死率增加，照射時間為60s時致死率達到70%，將該劑量作為紫外誘變最適劑量。

圖1 紫外照射的致死率曲線

2.2 突變株篩選

利用β－半乳糖苷酶分解X－gal使其變為藍色的特點，從平板上挑取深藍色菌落，進行搖瓶培養，破碎細胞，測定β－半乳糖苷酶酶活。表2列出了產酶水平明顯提高的8株菌的酶活水平，并與出發菌株進行了比較，其中M2酶活提高最大，產酶水平較出發株提高了89%，遺傳穩定性實驗表明該突變株連續傳代5次，酶活水平基本穩定(表3)。

表3 突變株M2的遺傳穩定性

2.3 培養基成分及pH對產酶水平的影響

2.3.1 碳源的影響 碳源不僅影響到微生物的生長，而且關系到酶的誘導與表達。為此，本文選取了1%單糖(葡萄糖、半乳糖)、雙糖(乳糖、果糖和蔗糖)以及多糖(糊精)為碳源，考察其對β－半乳糖苷酶的影響，培養基中的其他成分為酵母膏0.5%、蛋白胨1%，以酶活性最高者為100%，結果表明，在沒有乳糖誘導物存在的條件下，Arthrobacter sp.M2的β－半乳糖苷酶為低水平組成型表達，乳糖能夠促進其合成(圖2)。進一步的研究表明，乳糖的適宜濃度為1%。

2.3.2 氮源的影響 氮源作為發酵培養基中的一個主要元素，對菌體的生長和產酶發揮著重要的作用。本文以1%乳糖為碳源，考察了1%的蛋白胨、酵母膏、玉米漿、NH4Cl、尿素、(NH4)2SO4對產酶的影響，結果表明玉米漿為適宜的氮源(圖3)。進一步的研

圖3 氮源對Arthrobacter sp.M2發酵產酶的影響

2.3.3 培養基初始pH的影響 培養基中的pH關系到細胞膜所帶電荷，從而影響細胞對營養物質的吸收及產物的分泌。在本文所考察的pH范圍內，Arthrobacter sp.M2產酶的適宜pH為7.0(圖4)。

圖2 碳源對Arthrobacter sp.M2發酵產酶的影響究表明，玉米漿的適宜濃度為2%。

圖4 培養基初始pH對Arthrobacter sp.M2發酵產酶的影響

2.3.4 發酵培養基的優化 在對培養基碳、氮源、初始pH研究的基礎上，結合三價鐵離子對β－半乳糖苷酶的促進作用，采用L9(34)正交實驗因素水平表，設計了9組實驗，優化M2產酶培養基，結果如表4所示。極差分析表明，各因素對酶活的影響程度依次為A＞D＞C＞B，即乳糖濃度對Arthrobacter sp.M2發酵產β－半乳糖苷酶的影響最大，其次為初始pH和Fe3+濃度，玉米漿濃度對其影響較小。A2B3C2D2為最優水平組合，即乳糖濃度為10g/L，玉米漿濃度為22g/L，Fe3+濃度為1.5mmol/L，初始 pH 為7。由于正交實驗中不包含該組合，進一步做驗證實驗表明，酶活達到1.875U/m L，因此該培養基為最佳實驗組合。

3 結論

3.1 以具有轉苷活力的節桿菌為出發菌株，經過紫外線照射，用致死率達到70%的照射時間處理細胞，在含有X－gal的篩選培養基上，篩選深藍色突變株，進行搖瓶培養，得到8株酶活水平顯著提高的菌株，其中產酶能力最強的Arthrobacter sp.M2酶活力較出發菌株提高了89%，連續傳代5次，穩定性良好。

表4 正交實驗結果表

3.2 比較碳源、氮源對Arthrobacter sp.M2產酶影響，結果表明乳糖、玉米漿對產酶有利，進一步的正交優化得到最佳培養基為:乳糖濃度10g/L，玉米漿濃度22g/L，Fe3+濃度1.5mmol/L，初始 pH7。

3.3 紫外誘變結合培養基優化有效地提高了節桿菌產β－半乳糖苷酶的水平。

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Mutagenesis，screening and medium optimization for the production enhancement ofβ－galactosidase from Arthrobacter

TANG Lei1，DONG Xiao－xuan1，LIZhen－ai1，SUN Hui－hui1，YANG Rui－jin2，MAO Zhong－gui1，*
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China;
2.School of Food Science ＆ Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

The enzymatic synthesis of lactulose needs the β － galactosidase with both hydolysis and transgalactosylation activities as catalyst.Improving the productivity of such kind of enzyme is necessary. Naturally isolated Arthrobacter sp. was mutated with ultraviolent radiation. The mutants with higher β － galactosidase productivities were obtained by the screening on the selective medium with 5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－Dgalactopyranoside(X－ gal) as indicator and then by the liquid fermentation. The productivity of the best mutant Arthrobacter sp.M2 was 89% higher than the wild type.The optimum medium for the β－galactosidase production determined through orthogonal test was lactose 10g /L，corn syrup 22g/L，Fe3+1.5mm ol/L.The productivity was futher increased 113%using the optimized medium.Ultraviolet mutagenesis combined with medium optimization improved the productivity ofβ－galac tosidase from Arthrobacter effectively.

Arthrobacter sp.;ultraviolet mutagenesis;β－galac tosidase

TS201.3

A

1002－0306(2011)07－0192－03

2010－06－22 *通訊聯系人

唐蕾(1966－)，女，博士，副教授，研究方向:發酵工程。

國家863探索項目(2006AA10Z336)。