根癌農桿菌介導水稻香味基因的遺傳轉化

吳 娟，徐 全，韓 靜，孫婷婷，楊 芳，馬長江，魏和平

(安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶 246011)

根癌農桿菌介導水稻香味基因的遺傳轉化

吳 娟，徐 全，韓 靜，孫婷婷，楊 芳，馬長江，魏和平

(安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶 246011)

以日本腈為材料，研究根癌農桿菌介導水稻香味基因的遺傳轉化。研究結果表明，通過農桿菌介導的方法將水稻香味基因badh2導入了水稻粳稻品種日本腈中，并獲得轉基因植株。通過PCR檢測，初步證明外源基因badh2已整合到日本腈基因組中。

根癌農桿菌，水稻，香味基因，遺傳轉化

隨著人們生活水平的提高，消費者對稻米品質的要求越來越高。香米具有特殊的香味，廣泛受到市場和消費者的親睞，其銷售價格往往比普通大米要高出許多。由于香米在市場上的地位，各國育種工作者一直十分重視香米品種的選育［1］。隨著水稻的遺傳育種研究的不斷深入和水稻基因組測序工作的完成，人們開始利用轉基因技術來獲得水稻優良品種［2］。目前，廣泛采用的基因改造方法是根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系［3－4］。以根癌農桿菌介導的水稻轉化方法已比較成熟，轉化效率亦能滿足研究需要，如Chan［5］等以農桿菌介導的方法轉化水稻，成功地獲得了轉基因植株;Hiei［6］等首先實現粳稻的高效轉化，并于1996年同時獲得秈稻的轉化植株，實現了秈稻群體的高效轉化［7］。盡管農桿菌介導水稻轉化技術已比較成熟，但是利用農桿菌介導轉化水稻香味基因的研究，目前無一報道。本研究擬利用農桿菌介導轉化水稻香味基因，以期獲得轉基因水稻植株。通過農桿菌介導的基因遺傳轉化，嘗試將水稻香味基因轉入非香水稻品種，以建立優化的水稻遺傳轉化體系，拓寬香稻育種的遺傳背景，選育出高產穩產、香味濃郁的優質香米品種，以滿足國內外市場的需求。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

根癌農桿菌EHA105 高致癌性農桿菌菌株，植物表達載體pCAMBIA1302－badh2(含卡那霉素抗性基因)，均由安慶師范學院生命科學院細胞與遺傳實驗室保存和提供，電擊法轉化農桿菌EHA105，陽性克隆經PCR鑒定后用于水稻轉化;受體材料 粳稻品種日本腈成熟胚或誘導的愈傷組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 水稻愈傷組織的誘導［8］水稻種子去殼，第1次用加吐溫20(1滴每50m L溶液)的2.5%NaClO溶液浸泡15min，無菌水清洗5次;第2次用不加吐溫的2.5%NaClO滅菌15min，無菌水洗凈后平置誘導培養基上，32℃、24h光照條件下誘導愈傷組織。

1.2.2 根癌農桿菌的電擊轉化［9］將根癌農桿菌EHA105單菌落接入5m L YM培養基中，28℃振蕩培養過夜，8000 r/m in離心10m in，收集菌體，用預冷的無菌雙蒸水洗滌4次，用無菌預冷10%的甘油洗滌，離心，再用1m L無菌預冷的10%甘油重懸菌體，取200μL菌懸液置于1.5m L離心管中，再加入5μL質粒DNA，混勻并轉移至無菌預冷的電擊杯中(電極間距為0.1cm)，吸干電擊杯表面的水，將電擊杯放入電轉化儀的電極之間，在高壓11kV/cm下電擊5ms，取出電擊杯，迅速加入1m L YM液體培養基，混勻并轉移細胞至1.5m L的離心管中，在28℃搖蕩孵育3h，取適量菌液涂布選擇培養基，28℃培養，觀察轉化子。

1.2.3 農桿菌浸染愈傷組織［8］經活化培養后的含目標基因的農桿菌重懸于AAM液體培養基，并調OD600至0.1，選取生長狀況良好且一致的8d齡的愈傷組織置于農桿菌菌液中浸泡5m in，然后在25℃、黑暗條件下共培養3d;共培養后用含0.5g/L羧芐青霉素的無菌水清洗5次共30m in，轉入篩選培養基，32℃、24h光照條件下培養14d;直接將新生的抗性愈傷組織移入再生培養基進行分化培養，條件為22℃、16h光照，當再生芽長到2cm左右時進行生根培養。

1.2.4 轉化體的獲得 新鮮愈傷組織將有綠點出現，每2周繼代一次，待分化出完整小苗后轉入壯苗培養基MS中，煉苗并移栽。

1.2.5 轉基因個體的檢測 生根后煉苗時取少量葉片，提取水稻總DNA。根據badh2［10］基因的5'和3'端序列設計一對引物，P1:5'GGTTGCATTTACTGGGAGTT'和P2:5'CAGTGAAACAGGCTGTCAAG'。PCR擴增條件:94℃預變性 5m in;94℃ 45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35個循環，72℃延伸10m in。PCR擴增體系:取DNA模板 1μL，10 倍 PCR 緩沖液 2μL，引物 2μL，dNTPs 2μL，Taq DNA 聚合酶 0.5μL，總反應體積為 20μL。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，鑒定基因組中是否轉入目的基因。

2 結果與分析

2.1 根癌農桿菌Ti質粒介導轉化及陽性轉化子的篩選

將根癌農桿菌EHA105 200μL菌懸液于1.5m L離心管，加5μL質粒DNA于菌液中，混勻并轉移至無菌預冷的電擊杯中(電極間距為0.1cm)，在11kV/cm電壓下電擊5ms，然后取適量菌液涂布選擇培養基，觀察并篩選陽性轉化子(見圖1)。

圖1 陽性轉化子的篩選

根癌農桿菌懸液在11kV/cm的瞬間高壓下，細胞膜兩端會產生一個電位，一旦細胞膜上所產生的電位超過一定限度時，膜會局部破裂，從而導致外源DNA進入細胞。圖1是電擊轉化后細菌質粒DNA在經PCR、瓊脂糖凝膠電泳后的檢測圖，圖中“陽性轉化子”是在引物1、2引導下經PCR擴增的badh2基因的一段260bp左右的DNA片段。由圖1可知，通過根癌農桿菌介導電擊轉化，已獲得陽性轉化子(見圖1)，即證明badh2基因表達載體已成功地轉化到EHA105中。

2.2 水稻愈傷組織的誘導及根癌農桿菌的浸染

水稻種子去殼，第1次用加吐溫20(1滴每50m L溶液)的2.5%NaClO溶液浸泡15min，無菌水清洗5次;第2次用不加吐溫的2.5%NaClO滅菌15m in，無菌水洗凈后平置誘導培養基上，32℃、24h光照條件下誘導愈傷組織(見圖2)。

圖2 水稻的愈傷組織和轉化幼苗

經活化培養后的含目標基因的農桿菌重懸于AAM液體培養基，并調OD600至0.1，選取生長狀況良好且一致的8d齡的愈傷組織置于農桿菌菌液中浸泡5m in，然后在25℃、黑暗條件下共培養3d;共培養后用含0.5g/L羧芐青霉素的無菌水清洗5次共30m in，轉入篩選培養基，32℃、24h光照條件下培養14d;直接將新生的抗性愈傷組織移入再生培養基進行分化培養，條件為22℃、16h光照，當再生芽長到2cm左右時進行生根培養。

2.3 轉基因個體的檢測

生根后煉苗時取少量葉片，提取水稻總DNA。DNA提取方法按照吳娟［11］“水稻基因組DNA微量提取”方法進行，然后以水稻總DNA為模板，在badh2基因內部1對引物的引導下，PCR擴增badh2基因的特異性序列后，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。

圖3 轉基因個體的檢測

由圖3可知，以根癌農桿菌介導轉化水稻香味基因badh2，已獲得轉基因個體。圖3中植株個體編號2、3、4等均已擴增出水稻香味基因的特異性片段，即證明香味基因badh2已成功轉入水稻植物內。

3 討論

隨著基因工程技術的不斷發展和完善，基因轉化成為近年來國內外科研工作者的研究熱點，它不僅有利于培育高產、優質、抗病蟲害和抗逆境等具有多個優良性狀的作物品種［12］，可以通過后代分離獲得無選擇標記的轉基因植株，克服轉基因安全性的問題，更為進行多基因控制的生化代謝途徑的研究開辟了新的領域［13］。

本研究利用農桿菌介導法對水稻香味基因轉化系統進行了研究，以日本腈成熟種子為材料，以8d齡愈傷組織浸染5m in，以普通瓊脂作為凝固劑在40d左右就得到了陽性的T0代水稻植株，有目的地將香味基因快速導入日本腈水稻親本中，為培育優良水稻品種和遺傳育種工作奠定了一定實驗基礎，且建立的優化的水稻遺傳轉化體系，拓寬了香稻育種的遺傳背景，選育出高產穩產、香味濃郁的優質香米品種，以滿足國內外市場的需求。

［1］王軍，楊杰，陳志德，等.水稻香米基因標記的開發與應用［J］.分子植物育種，2008，6(6):1209－1212.

［2］王豐，李金華，柳武革，等.一種水稻香味基因功能標記的開發［J］.中國水稻科學，2008，22(4):347－352.

［3］鄭杰.農桿菌介導的高效水稻遺傳轉化體系的研究［J］.湖南農業科學，2008(2):6－7.

［4］汪秀志，張紅宇，汪旭東，等.農桿菌介導的水稻雙基因共轉化初步研究［J］.核農學報，2009，23(1):28－32.

［5］Chan mT，Chang H H，Ho S L，et al.Agrobacterium－mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric co－amylasepromoter/β－glucuronidase gene［J］.Plant Mol Boil，1993，22，491－506.

［6］Hiei Y，Ohta S，Komari T，etal.Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T－DNA［J］.Plant J，1994，6(2):271－282.

［7］Hiei Y，Komari T.Improved protocols for transformation of indicaricemediated by Agrobacterium tumefaciens［J］.Plant Cell Tiss Org Cult，2006，85:271－283.

［8］蘇益，黃善金，藺萬煌，等.根癌農桿菌介導的水稻快速轉化方法研究［J］.中國農學通報，2008，24(5):83－86.

［9］匡小嬰，饒志明，沈微，等.影響根癌農桿菌的電擊轉化條件［J］.食品與生物技術學報，2005，24(4):13－16.

［10］史薇薇.水稻米香基因標簽標記的開發與利用［D］.揚州大學碩士學位論文，2007.

［11］吳娟，吳金平.水稻基因組DNA微量提取［J］.生物學雜志，2007，24(4):55－57.

［12］胡亞軍，劉雄倫，江南，等.水稻OsSAMT1基因的克隆及其遺傳轉化［J］.湖南農業大學學報:自然科學版，2009，35(4):4362－365.

［13］丁盛，劉清，黃志剛，等.反義 Waxy基因轉化秈稻9311的初步研究［J］.湖南農業大學學報:自然科學版，2009，35(4):366－368.

Genetic transformation mediated by agrobacterium with fragrant gene in rice

WU Juan，XU Quan，HAN Jing，SUN Ting－ting，YANG Fang，MA Chang－jiang，WEIHe－ping
(Anqing Teachers’College，Life Science School，Anqing 246011，China)

Rice variety nipponbar was tested as experimental materials.By agrobacterium－mediated method，rice aroma gene will be transformed into nipponbar.The results showed that in this method，fragrant gene badh2 in rice was triumphantly transformed into nipponbar and transgenic plants were obtained. By PCR testing，the result indicated that the foreign gene badh2 had been integrated into the genome of the nipponbar.

agrobacterium;rice;fragrant gene;genetic transformation

TS201.1

A

1002－0306(2011)07－0195－03

2010－06－17

吳娟(1980－)，女，碩士，講師，主要從事遺傳學教學和科研工作。

安徽省教育廳自然科學研究項目(KJ2009B085);安慶市科技局重點科技項目(20090616);安慶師范學院2010年青年科研基金(KJ201014)。