根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻香味基因的遺傳轉(zhuǎn)化

吳 娟，徐 全，韓 靜，孫婷婷，楊 芳，馬長(zhǎng)江，魏和平

(安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶 246011)

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻香味基因的遺傳轉(zhuǎn)化

吳 娟，徐 全，韓 靜，孫婷婷，楊 芳，馬長(zhǎng)江，魏和平

(安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶 246011)

以日本腈為材料，研究根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻香味基因的遺傳轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果表明，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將水稻香味基因badh2導(dǎo)入了水稻粳稻品種日本腈中，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR檢測(cè)，初步證明外源基因badh2已整合到日本腈基因組中。

根癌農(nóng)桿菌，水稻，香味基因，遺傳轉(zhuǎn)化

隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)稻米品質(zhì)的要求越來(lái)越高。香米具有特殊的香味，廣泛受到市場(chǎng)和消費(fèi)者的親睞，其銷售價(jià)格往往比普通大米要高出許多。由于香米在市場(chǎng)上的地位，各國(guó)育種工作者一直十分重視香米品種的選育［1］。隨著水稻的遺傳育種研究的不斷深入和水稻基因組測(cè)序工作的完成，人們開(kāi)始利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)獲得水稻優(yōu)良品種［2］。目前，廣泛采用的基因改造方法是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系［3－4］。以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法已比較成熟，轉(zhuǎn)化效率亦能滿足研究需要，如Chan［5］等以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株;Hiei［6］等首先實(shí)現(xiàn)粳稻的高效轉(zhuǎn)化，并于1996年同時(shí)獲得秈稻的轉(zhuǎn)化植株，實(shí)現(xiàn)了秈稻群體的高效轉(zhuǎn)化［7］。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)已比較成熟，但是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻香味基因的研究，目前無(wú)一報(bào)道。本研究擬利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻香味基因，以期獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因遺傳轉(zhuǎn)化，嘗試將水稻香味基因轉(zhuǎn)入非香水稻品種，以建立優(yōu)化的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，拓寬香稻育種的遺傳背景，選育出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、香味濃郁的優(yōu)質(zhì)香米品種，以滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

根癌農(nóng)桿菌EHA105 高致癌性農(nóng)桿菌菌株，植物表達(dá)載體pCAMBIA1302－badh2(含卡那霉素抗性基因)，均由安慶師范學(xué)院生命科學(xué)院細(xì)胞與遺傳實(shí)驗(yàn)室保存和提供，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定后用于水稻轉(zhuǎn)化;受體材料 粳稻品種日本腈成熟胚或誘導(dǎo)的愈傷組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)［8］水稻種子去殼，第1次用加吐溫20(1滴每50m L溶液)的2.5%NaClO溶液浸泡15min，無(wú)菌水清洗5次;第2次用不加吐溫的2.5%NaClO滅菌15min，無(wú)菌水洗凈后平置誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，32℃、24h光照條件下誘導(dǎo)愈傷組織。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌的電擊轉(zhuǎn)化［9］將根癌農(nóng)桿菌EHA105單菌落接入5m L YM培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，8000 r/m in離心10m in，收集菌體，用預(yù)冷的無(wú)菌雙蒸水洗滌4次，用無(wú)菌預(yù)冷10%的甘油洗滌，離心，再用1m L無(wú)菌預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，取200μL菌懸液置于1.5m L離心管中，再加入5μL質(zhì)粒DNA，混勻并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌預(yù)冷的電擊杯中(電極間距為0.1cm)，吸干電擊杯表面的水，將電擊杯放入電轉(zhuǎn)化儀的電極之間，在高壓11kV/cm下電擊5ms，取出電擊杯，迅速加入1m L YM液體培養(yǎng)基，混勻并轉(zhuǎn)移細(xì)胞至1.5m L的離心管中，在28℃搖蕩孵育3h，取適量菌液涂布選擇培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 農(nóng)桿菌浸染愈傷組織［8］經(jīng)活化培養(yǎng)后的含目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌重懸于AAM液體培養(yǎng)基，并調(diào)OD600至0.1，選取生長(zhǎng)狀況良好且一致的8d齡的愈傷組織置于農(nóng)桿菌菌液中浸泡5m in，然后在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3d;共培養(yǎng)后用含0.5g/L羧芐青霉素的無(wú)菌水清洗5次共30m in，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，32℃、24h光照條件下培養(yǎng)14d;直接將新生的抗性愈傷組織移入再生培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，條件為22℃、16h光照，當(dāng)再生芽長(zhǎng)到2cm左右時(shí)進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)化體的獲得 新鮮愈傷組織將有綠點(diǎn)出現(xiàn)，每2周繼代一次，待分化出完整小苗后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS中，煉苗并移栽。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因個(gè)體的檢測(cè) 生根后煉苗時(shí)取少量葉片，提取水稻總DNA。根據(jù)badh2［10］基因的5'和3'端序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，P1:5'GGTTGCATTTACTGGGAGTT'和P2:5'CAGTGAAACAGGCTGTCAAG'。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性 5m in;94℃ 45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10m in。PCR擴(kuò)增體系:取DNA模板 1μL，10 倍 PCR 緩沖液 2μL，引物 2μL，dNTPs 2μL，Taq DNA 聚合酶 0.5μL，總反應(yīng)體積為 20μL。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定基因組中是否轉(zhuǎn)入目的基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

將根癌農(nóng)桿菌EHA105 200μL菌懸液于1.5m L離心管，加5μL質(zhì)粒DNA于菌液中，混勻并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌預(yù)冷的電擊杯中(電極間距為0.1cm)，在11kV/cm電壓下電擊5ms，然后取適量菌液涂布選擇培養(yǎng)基，觀察并篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(見(jiàn)圖1)。

圖1 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

根癌農(nóng)桿菌懸液在11kV/cm的瞬間高壓下，細(xì)胞膜兩端會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電位，一旦細(xì)胞膜上所產(chǎn)生的電位超過(guò)一定限度時(shí)，膜會(huì)局部破裂，從而導(dǎo)致外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。圖1是電擊轉(zhuǎn)化后細(xì)菌質(zhì)粒DNA在經(jīng)PCR、瓊脂糖凝膠電泳后的檢測(cè)圖，圖中“陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子”是在引物1、2引導(dǎo)下經(jīng)PCR擴(kuò)增的badh2基因的一段260bp左右的DNA片段。由圖1可知，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)電擊轉(zhuǎn)化，已獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(見(jiàn)圖1)，即證明badh2基因表達(dá)載體已成功地轉(zhuǎn)化到EHA105中。

2.2 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)及根癌農(nóng)桿菌的浸染

水稻種子去殼，第1次用加吐溫20(1滴每50m L溶液)的2.5%NaClO溶液浸泡15min，無(wú)菌水清洗5次;第2次用不加吐溫的2.5%NaClO滅菌15m in，無(wú)菌水洗凈后平置誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，32℃、24h光照條件下誘導(dǎo)愈傷組織(見(jiàn)圖2)。

圖2 水稻的愈傷組織和轉(zhuǎn)化幼苗

經(jīng)活化培養(yǎng)后的含目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌重懸于AAM液體培養(yǎng)基，并調(diào)OD600至0.1，選取生長(zhǎng)狀況良好且一致的8d齡的愈傷組織置于農(nóng)桿菌菌液中浸泡5m in，然后在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3d;共培養(yǎng)后用含0.5g/L羧芐青霉素的無(wú)菌水清洗5次共30m in，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，32℃、24h光照條件下培養(yǎng)14d;直接將新生的抗性愈傷組織移入再生培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，條件為22℃、16h光照，當(dāng)再生芽長(zhǎng)到2cm左右時(shí)進(jìn)行生根培養(yǎng)。

2.3 轉(zhuǎn)基因個(gè)體的檢測(cè)

生根后煉苗時(shí)取少量葉片，提取水稻總DNA。DNA提取方法按照吳娟［11］“水稻基因組DNA微量提取”方法進(jìn)行，然后以水稻總DNA為模板，在badh2基因內(nèi)部1對(duì)引物的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增badh2基因的特異性序列后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)基因個(gè)體的檢測(cè)

由圖3可知，以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻香味基因badh2，已獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體。圖3中植株個(gè)體編號(hào)2、3、4等均已擴(kuò)增出水稻香味基因的特異性片段，即證明香味基因badh2已成功轉(zhuǎn)入水稻植物內(nèi)。

3 討論

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因轉(zhuǎn)化成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外科研工作者的研究熱點(diǎn)，它不僅有利于培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲害和抗逆境等具有多個(gè)優(yōu)良性狀的作物品種［12］，可以通過(guò)后代分離獲得無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株，克服轉(zhuǎn)基因安全性的問(wèn)題，更為進(jìn)行多基因控制的生化代謝途徑的研究開(kāi)辟了新的領(lǐng)域［13］。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻香味基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了研究，以日本腈成熟種子為材料，以8d齡愈傷組織浸染5m in，以普通瓊脂作為凝固劑在40d左右就得到了陽(yáng)性的T0代水稻植株，有目的地將香味基因快速導(dǎo)入日本腈水稻親本中，為培育優(yōu)良水稻品種和遺傳育種工作奠定了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，且建立的優(yōu)化的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，拓寬了香稻育種的遺傳背景，選育出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、香味濃郁的優(yōu)質(zhì)香米品種，以滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求。

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Genetic transformation mediated by agrobacterium with fragrant gene in rice

WU Juan，XU Quan，HAN Jing，SUN Ting－ting，YANG Fang，MA Chang－jiang，WEIHe－ping
(Anqing Teachers’College，Life Science School，Anqing 246011，China)

Rice variety nipponbar was tested as experimental materials.By agrobacterium－mediated method，rice aroma gene will be transformed into nipponbar.The results showed that in this method，fragrant gene badh2 in rice was triumphantly transformed into nipponbar and transgenic plants were obtained. By PCR testing，the result indicated that the foreign gene badh2 had been integrated into the genome of the nipponbar.

agrobacterium;rice;fragrant gene;genetic transformation

TS201.1

A

1002－0306(2011)07－0195－03

2010－06－17

吳娟(1980－)，女，碩士，講師，主要從事遺傳學(xué)教學(xué)和科研工作。

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2009B085);安慶市科技局重點(diǎn)科技項(xiàng)目(20090616);安慶師范學(xué)院2010年青年科研基金(KJ201014)。