不同采收時期莢果蕨營養葉中總黃酮含量測定

劉百萍，馬 驥，張曉靜，張 昊，朱貞貞

(1.陜西師范大學生命科學學院，陜西西安 710062;

2.教育部藥用植物資源及天然藥物化學重點實驗室，陜西西安 710062)

不同采收時期莢果蕨營養葉中總黃酮含量測定

劉百萍，馬 驥*，張曉靜，張 昊，朱貞貞

(1.陜西師范大學生命科學學院，陜西西安 710062;

2.教育部藥用植物資源及天然藥物化學重點實驗室，陜西西安 710062)

目的:優化回流萃取、RP－HPLC檢測莢果蕨中槲皮素、山奈酚含量的方法，比較不同采收時期莢果蕨營養葉中總黃酮含量，得出莢果蕨營養葉的最佳采收時期。方法:色譜條件:色譜柱Shimadzu C18(250×4.6mm，5μm);流動相為甲醇(A)－0.2%磷酸水(B);采用線性梯度洗脫;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃;檢測波長為360nm;進樣量20μL。結果:槲皮素在0.18～4.5μg(r2=0.9992)，山奈酚在0.17～4.25μg(r2=0.9994)范圍內進樣量與峰面積呈良好的線性關系。加樣回收率分別為99.6%、99.45%，RSD值為1.90%，0.91%(n=6)。結論:該方法操作簡便，結果準確，重現性好，可用于莢果蕨的質量評價。9月份采收的莢果蕨營養葉中總黃酮含量最高，實驗結果可用于指導合理采收開發莢果蕨資源。

莢果蕨，總黃酮，不同采收時期，高效液相色譜法

莢果蕨(Matteuccia struthiopteris(L.)Todaro)俗名廣東菜、黃瓜香、莢果蕨貫眾，是球子蕨科(Onocleaceae)莢果蕨屬的植物。我國黑龍江、吉林、河北、河南、陜西及西藏等地有廣泛分布，多生長于山谷林下及河岸濕地，海拔80～3000m間。莢果蕨是著名的山野菜，其幼葉營養可口，具有鮮黃瓜的清香，在東北地區常常作為出口野菜。莢果蕨具有藥用價值，在秦巴山區應用廣泛，是商品貫眾的一種［1－2］。其根狀莖及葉柄殘基可入藥，有清熱解毒、殺蟲、止血、預防流感的功效。由于莢果蕨植株形狀優美，也可作為室內盆栽或用作室外觀賞植物。黃酮類化合物是一類在植物中含量豐富的植物次生代謝產物，楊嵐等人研究報道，莢果蕨中含有芹菜素、莢果蕨素、去甲氧基莢果蕨素、莢果蕨黃素等黃酮類化合物［3－4］;李娜等研究表明，槲皮素是球子蕨科共有成分［5］;洪葉嵐等的研究表明，莢果蕨營養葉中含山奈酚、槲皮素［6］。黃酮類化合物具有抗衰老、抗癌、抑菌、保健等功效。槲皮素有很強的抗氧化作用，可透過血腦屏障，并對人膠質母細胞瘤U251細胞有明顯的抑制增殖及誘導凋亡作用［7］;山奈酚能抑制與兒童髓母細胞瘤生長和轉移有關的肝細胞生長因子及其受體酪氨酸蛋白激酶［8］，抑制人胃癌細胞MGC2803的增殖并誘導其凋亡［9］。本文參照洪葉嵐等的方法［6］，對莢果蕨中槲皮素、山奈酚進行了提取及檢測條件的優化，4月到9月是莢果蕨營養葉的生長期，對不同采收時期莢果蕨營養葉中的槲皮素、山奈酚及總黃酮含量的變化規律進行了研究，為合理開發利用莢果蕨提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素、山柰酚對照品 中國藥品生物制品檢定所，含量純度分別為97.3%、95.9%，批號分別為110861－200606、100081－200406;樣品 莢果蕨于2009年4月至9月采自陜西省安康市旬陽壩林場，經陜西師范大學生命科學學院肖婭萍教授、馬驥副教授鑒定為莢果蕨，標本現存于陜西師范大學生命科學學院植物學標本室;甲醇 色譜純;水 超純水;其余試劑 均為分析純。

Shimadzu LC－2010高效液相色譜儀 日本島津公司;HH－6B數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;RE－52AA旋轉蒸發器、SHB－Ⅲ循環水式多用真空泵 上海亞榮生化儀器廠;KQ－300DE型數控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;DAD檢測器，AT2201電子分析天平(d=0.1mg)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Shimadzu C18(250×4.6mm，5μm);流動相為甲醇(A)－0.2%磷酸水(B);采用線性梯度洗脫(0→30m in，甲醇40%→65%，0.2%磷酸水60%→35%);流速為1.0m L/m in;柱溫為30℃;檢測波長為360nm;進樣量為20μL，見圖1。

圖1 槲皮素、山奈酚對照品(A)和樣品(B)的HPLC

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品、山奈酚對照品適量，加甲醇溶解，配制成槲皮素濃度為0.18mg/m L、山奈酚濃度為0.17mg/m L的對照品溶液，于4℃冰箱避光保存。

1.2.3 樣品溶液的制備 材料清洗、陰干、粉碎、過65目篩，精密稱取待測莢果蕨粉末 1.000g，置于50m L圓底燒瓶中，加30m L 90%乙醇，于80℃恒溫水浴鍋中回流提取1h，取出后加入2m L鹽酸回流酸解1h。取出冷卻至室溫，抽濾，濾液減壓蒸干，用甲醇定容至10m L容量瓶，搖勻，用微孔濾膜(0.22μm)過濾，待測。

1.2.4 提取溶劑和提取方法的優化 根據槲皮素、山奈酚的理化性質，結合相關文獻［10，12］，選用了不同濃度的甲醇(100%、90%、80%、70%、60%)、乙醇(100%、95%、90%、80%、70%、60%)為提取溶劑，溶劑量分別為 10、15、20、25、30m L，回流時間 1、1.5、2、2.5、3h以及提取溫度 70、80、90℃進行比較提取，結果顯示，90%乙醇80℃恒溫水浴回流提取2h，槲皮素、山奈酚的提取率高，效果最好。

1.2.5 檢測條件的優化 比較了用甲醇－水、甲醇－0.2%磷酸水、甲醇－0.4%磷酸水作為流動相，進行等度、梯度洗脫，結果顯示，用等度洗脫時2種物質的分離效果不好，流動相為甲醇(A)－0.2%磷酸水(B);采用線性梯度洗脫(0→30m in，甲醇40%→65%，0.2%磷酸水60%→35%)的分離效果好，峰形好。

1.2.6 總黃酮含量的計算 總黃酮含量的計算參照05版藥典中銀杏葉提取物總黃酮甙含量計算方法［13］計算。

2 結果與討論

2.1 線性關系考察

精密吸取槲皮素對照品溶液 1、5、10、15、20、25μL，在1.2.1的色譜條件下分別進樣，記錄其峰面積，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得線性回歸方程:Y=581779X+175532(R2=0.9992)，線性范圍:0.18～4.5μg。

精密吸取山奈酚對照品溶液 1、5、10、15、20、25μL進樣，記錄其峰面積，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得回歸方程Y=684356X+157868(R2=0.9994)，線性范圍:0.17～4.25μg。

2.2 精密度考察

取上述對照品溶液，重復測定6次，每次進樣20μL。分別測得槲皮素的峰面積為 14561876、14544310、14779626、14644654、14542950、14852327;山奈酚的峰面積為 25159070、25352290、25680726、25359558、25048931、25443491。計算槲皮素，山奈酚峰面積的 RSD值，結果為槲皮素0.91%、山奈酚0.87%(n=6)，精密度良好。

2.3 重復性考察

取同一份樣品6份，按照1.2.3中方法制備供試品溶液，精密吸取20μL進樣，測定槲皮素、山奈酚峰面積，計算含量。得槲皮素的含量分別為1.139、1.144、1.122、1.147、1.123、1.135mg/g;山奈酚的含量分別為 2.427、2.513、2.438、2.439、2.507、2.454mg/g。計算2種成分含量的RSD值分別為0.93%、1.52%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.4 穩定性考察

取同一樣品溶液，按照1.2.3中方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別在提取后的0、6、12、18、24、36、48h進行檢測，記錄槲皮素、山奈酚峰面積，得槲皮素的峰面積分別為 754799、732009、756538、743277、732975、721453、740996;山奈酚的峰面積為1997434、1998332、1945093、1924807、1989091、1944003、1931907。計算其 RSD值，結果分別為1.71%、1.64%(n=7)，表明該樣品溶液在48h內穩定性良好。

2.5 加樣回收率實驗

精密稱取1.000g已知含量的樣品6份，分別加入適量對照品溶液，按上述供試品的制備方法制成供試品溶液，進樣測定，計算回收率及RSD值，結果見表1、表2。

表1 莢果蕨中槲皮素的加樣回收率

表2 莢果蕨中山奈酚的加樣回收率

2.6 樣品測定

按照1.2.3所述方法分別對9月份采集的莢果蕨樣品的不同部位及不同采收期的莢果蕨營養葉樣品進行制備，按1.2.1所述色譜條件對樣品中槲皮素、山奈酚進行含量測定，結果見表3及圖2。

表3 莢果蕨不同部位中槲皮素、山奈酚的測定結果(n=3)

圖2 不同采收時期莢果蕨營養葉中槲皮素、山奈酚的測定結果

2.7 總黃酮含量

根據1.2.6中總黃酮甙含量計算方法，得出不同采收時期莢果蕨營養葉中總黃酮的含量，結果見圖3。

圖3 不同采收時期莢果蕨營養葉中總黃酮的含量

3 結論

在9月份后期采收的莢果蕨營養葉中總黃酮含量最高，此時孢子葉的孢子已生長成熟，保證了莢果蕨的繁殖能力。莢果蕨是多年生草本植物，根狀莖是其營養繁殖的根本保證，采收其營養葉提取黃酮類化合物，對莢果蕨資源的保護非常有利。本實驗中優化的反相高效液相色譜測定法操作簡單，結果可靠、準確，可為莢果蕨中黃酮類化合物的進一步研究開發提供依據。

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Determination of total flavonoids in Matteuccia struthiopteris(L.)Todaro foliage leaves of different harvest time

LIU Bai－ping，MA Ji*，ZHANG Xiao－jing，ZHANG Hao，ZHU Zhen－zhen

(1.Life Science College，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China;2.Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Plant Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，Xi’an 710062，China)

Using the methods of reflux extraction and detection of quercetin and kaempferol in Matteuccia struthiopteris(L.)Todaro by RP－HPLC，the content of flavonoid in different harvest periods and evaluated the optimal harvest time were compared.The separation of the targets was performed on Shimadzu C18(250mm×4.6mm，5μm)column with the column temperature at 30℃，by gradient elution using methanol－H2O with 0.2%phosphate acid as the mobile phase at the flow rate of1.0m L/m in，the detective wavelength was set at360nm.The linear range of quercetin was 0.18～4.5μg(r2=0.9992)and kaempferol was 0.17～4.25μg(r2=0.9994)，with average recoveries of 99.6%(RSD 1.90%)，99.45%(RSD 0.91%).The method was simple，accurate and reproducible，can be used for quality control of quercetin and kaempfero in Matteuccia struthiop teris(L.).The contents of flavonoid collected at september was the best.These can guide the reasonable collecting and make the best use of Matteuccia struthiop teris(L.)resource.

Matteuccia struthiop teris(L.)Todaro;flavonoid;different harvest time;HPLC

TS201.1

A

1002－0306(2011)07－0407－03

2010－12－08 *通訊聯系人

劉百萍(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:藥用植物資源研究。

國家“十一五”科技支撐計劃(2006BAI06A12－04)。