微波輔助提取-氣相色譜-質譜聯用快速分析花椒揮發油

房信勝，王 超，馬偉志，李明會，王建華,*，張 麗，徐 寧

(1.作物生物學國家重點實驗室，山東農業大學農學院，山東 泰安 271018；2.山東農業大學園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018)

微波輔助提取-氣相色譜-質譜聯用快速分析花椒揮發油

房信勝1，王 超2，馬偉志1，李明會1，王建華1,*，張 麗1，徐 寧1

(1.作物生物學國家重點實驗室，山東農業大學農學院，山東 泰安 271018；2.山東農業大學園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018)

建立微波輔助提取-氣相色譜-質譜聯用快速分析花椒揮發油的方法。采用微波輔助提取-水蒸氣蒸餾法(MAE-SD)提取揮發油，正交試驗設計優化微波輔助提取條件，氣相色譜-質譜聯用分析揮發油的化學成分和理化性質，同時將微波輔助提取與傳統水蒸氣蒸餾法進行比較。結果表明：MAE-SD的最佳工藝為微波功率400W、加水量15mL/g、浸泡30min，提取20min；經GC-MS分析，分離得到137種成分，質譜鑒定相似度在90%以上的化合物59種；根據峰面積歸一法，相對含量較高的成分有檜萜(3.72%)、β-月桂烯(8.34%)、樅萜(15.15%)、松油烯(3.65%)、桉樹腦(6.25%)、α-蒎烯(4.95%)、β-芳樟醇(3.05%)、4-萜品醇(10.48%)、松油醇(3.55%)、α-松油醇酯(4.09%)；與水蒸氣蒸餾法相比，揮發油的成分種類和理化性質接近，但相對含量存在一定差異。MAESD可快速高效提取揮發油類成分，聯合GC-MS可對揮發油進行快速分析。

花椒；揮發油；微波輔助提取；氣相色譜-質譜法

花椒為蕓香科植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)及青椒(Zanthoxylum schinifolium Sieb. Et Zucc.)的成熟果皮，是日常生活中重要的調味品，同時也是常用中藥材，具有溫中止痛、疏通血脈、殺蟲等功效?，F代藥理研究[1-4]表明，花椒揮發油具有抗菌、殺蟲、平喘等作用。揮發油的傳統提取方法為水蒸氣蒸餾法(steam distillation，SD)[5-6]。閻建輝[7]、郭治安[8]、邱琴[9]、陳訓[10]等分別采用水蒸氣蒸餾法提取山東濟南(果皮)、湖南岳陽(果實)、陜西富平(果皮)、四川茂縣(果實)產花椒揮發油，這種方法可獲得純凈揮發油、操作簡便，但耗時較長。趙麗娟等[11]比較了同時蒸餾萃取法和普通水蒸氣蒸餾萃取法提取太行山地區花椒揮發油。莫彬彬[12]、陳振德等[13]用超臨界CO2流體萃取法從花椒(果皮)中提取揮發油，但該法需要專用設備，限制了其應用，且提取物中多混有脂肪油、油樹脂等非揮發性成分。國外文獻報道的花椒揮發油的提取方法有水蒸氣蒸餾法、超聲提取法和微波提取法[14-16]。由于提取方法、產地以及所用花椒部位不同使不同報道對揮發油的分析結果有較大差異。

微波輔助提取法(microwave assisted extraction，MAE)具有提取速度快、產率高、操作簡便、避免成分變化等特點，在天然產物活性成分提取中已有較多報道[17-19]，但用于揮發油提取的報道較少。朱曉楠[20]、Wang[16]等采用非極性溶劑微波輔助(solvent-free microwave extraction，SFME)提取肉桂、花椒中的揮發油，但需要向提取溶劑中加入微波吸收介質，如羰基鐵粉；李焱等[21]采用微波處理后，再用乙醚蒸餾-萃取的方法提取貴陽刺異葉花椒揮發油，該法耗時長、過程較復雜。本實驗將微波輔助提取-水蒸氣蒸餾(MAE-SD)聯合應用，在顯著提高提取效率的同時，可獲得純凈的花椒揮發油，避免有機溶劑的使用；同時采用GC-MS 聯用技術分析和鑒定揮發油的化學成分，探索微波提取技術用于揮發油類成分提取的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒(產地山東萊蕪)。無水乙醇、甲醇、無水硫酸鈉(均為分析純)、正己烷(色譜純) 天津克密歐化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

MAS-I微波輔助萃取儀 上海新儀微波化學設備公司；GC-MS QP2010 Plus氣相色譜-質譜聯用儀、UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；WAY-2S型阿貝折光儀 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助萃取-水蒸氣蒸餾

取20～40目花椒粉末20g，置于燒瓶中，加水浸泡30min，放于微波萃取釜中，上端連接冷凝管和揮發油測定器，進行微波輔助提取-水蒸氣蒸餾提取揮發油，收集揮發油測定器中的油狀液體，無水硫酸鈉干燥。以微波功率、提取時間和加水量為考察因素，以提取產率為指標，采用L9(34)正交試驗設計優化微波輔助萃取的條件。

1.3.2 水蒸氣蒸餾法提取

按《中國藥典：一部附錄XD：揮發油測定法》提取5h，收集揮發油測定器中的油狀液體，無水硫酸鈉干燥。

1.3.3 揮發油的理化性質分析

對不同提取方法得到的揮發油進行理化性質分析。用十萬分之一分析天平通過稱量法測定揮發油密度；用阿貝折光儀于25℃測定折光率；用酸度計于25℃測定pH值；以甲醇為溶劑采用紫外分光光度法測定紫外吸收曲線。

1.3.4 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：色譜柱為Rxi-5ms(30m×0.32mm，0.25μm)，進樣口溫度250℃，程序升溫：起始溫度50℃，保持1min，以6℃/min升至140℃，接著以10℃/min升至180℃，再以15℃/min升至260℃，保持5min。進樣量1μL，載氣He，總流速27.2mL/min，柱流速2.20mL/min，分流比10:1。

質譜條件：連接質譜接口溫度250℃，電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV，離子源溫度200℃，掃描范圍m/z 40～500，掃描間隔1s。

2 結果與分析

2.1 MAE-SD方法的工藝優化

表1 MAE-SD方法工藝條件優化的L9(34)正交試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results of L9(34) orthogonal arrays

由表1可見，微波功率對產率的影響最大，功率越小，提取率越大。提取時間對提取率也有一定影響，提取20min 提取率即達到最大。加水量對提取率的影響最小，加水量15mL/g較為合適。因此微波輔助提取的最佳工藝為加水量15mL/g、浸泡30min 后采用400W功率提取20min。水利用微波能的效率高，微波輻照后能快速沸騰；花椒中的成分由于吸收微波能，分子運動加速，溶出速度顯著提高，并且由于水分子運動加速，揮發性成分能快速隨水蒸氣揮發出來。因此，采用微波輔助提取可顯著提高提取效率。2.2 不同提取方法的比較

表2 不同提取方法提取揮發油的提取率和理化性質Table 2 Comparisons on extraction efficiency, physicochemical properties and chemical composition of volatile oil from pricklyash peel by different extraction methods

2.2.1 提取產率和理化性質的比較

微波輔助提取按2.1節優化工藝進行，水蒸氣蒸餾按1.2.2節方法進行。不同提取方法揮發油的產率和理化性質見表2。結果表明，微波輔助提取20min的產率和水蒸氣蒸餾法5h的產率無顯著差異，所得揮發油的理化性質基本相同，因此采用本實驗的微波輔助提取不但可以快速提取花椒揮發油，而且能保持揮發油的理化性質不受影響。

2.2.2 揮發油的GC-MS 分析

圖1 不同提取方法提取花椒揮發油的總離子流圖譜Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile oils extracted by different extraction methods

采用GC-MS聯用分析測定不同提取方法所得揮發油。揮發油的總離子流圖如圖1所示。經檢索NIST05質譜庫、參考相關文獻[7-13]及根據各組分的特征性碎片離子進行質譜解析，相似度在90%以上的化合物及其相對含量見表3。

表3 不同提取方法提取花椒揮發油的化學成分及相對含量Table 3 Chemical components and their relative contents in volatile oils extracted by different extraction methods

續表3

圖1和表3表明，采用微波輔助提取時分離得到了137種成分，質譜鑒定相似度在90%以上的化合物59種，相對含量占揮發油總成分近90%；采用水蒸氣蒸餾法時分離得到了148種成分，質譜鑒定相似度在90%以上的化合物59種，相對含量占揮發油總成分的88.5%。由表3可知，花椒揮發油中的主要成分為檜萜(3.72%)、β-月桂烯(8.34%)、樅萜(15.15%)、松油烯(3.65%)、桉樹腦(6.25%)、α-蒎烯(4.95%)、β-芳樟醇(3.05%)、4-萜品醇(10.48%)、松油醇(3.55%)、α-松油醇酯(4.09%)，微波輔助提取時其相對含量均在3%以上，占揮發油總量的63%，與水蒸氣蒸餾提取的結果相近。β-月桂烯、樅萜、4-萜品醇和桉樹腦的相對含量均在5%以上，這4種化合物的結構及質譜圖見圖2，經質譜解析，其結構與相應離子碎片可一一對應。和已有文獻比較，α-蒎烯、檜萜、β-月桂烯、樅萜、桉樹腦、β-芳樟醇、4-萜品醇、薄荷酮等是不同產地花椒中揮發油的共有且含量較高的成分，這些成分也是重要的香料物質。另外，芳樟醇具有殺蟲、抗菌、抗病毒和鎮靜等作用，α-松油醇、4-萜品醇具有顯著的平喘作用，α-蒎烯、β-月桂烯具有明顯的祛痰、鎮咳作用，α-蒎烯還有抗真菌、驅蟲作用，桉樹腦具有消毒防腐作用。由此可見，花椒含有的主要揮發油不但可作為重要的香料成分，也是其殺蟲、抗菌、平喘等作用的重要物質基礎。

圖2 β-月桂烯(A)、4-萜品醇(B)、樅萜(C)和桉樹腦(D)的結構式和質譜圖Fig.2 Chemical structures and mass spectra of beta.-myrcene (A),sylvestren (B), 4-carvomenthenol (C) and cineole (D)

本實驗采用GC-MS聯用對花椒揮發油中非極性的烴類及極性較大的醇、酮、酯類等成分獲得了良好的分離和鑒定，并結合揮發油的理化性質進行分析。MAESD和SD法得到的揮發油成分種類接近，但成分的含量存在一定差異：微波輔助提取時烴類成分的相對含量低于傳統水蒸氣蒸餾法，如揮發油中相對含量較高的β-月桂稀、α-蒎烯、松油烯等；但對于含羥基的醇類或羰基的酯類、酮類、醛類等成分，如β-芳樟醇、4-萜品醇、松油醇、α-松油醇酯等，采用MAE-SD時其相對含量一般高于SD法。產生這種結果的原因與微波輔助提取的原理有關：不同結構的成分吸收利用微波能的效率不同，含羥基的醇類或羰基的酯類等成分易吸收微波能，從而更快的被提取出來，而烴類成分利用微波能的效率較低，采用微波提取時其含量相對較低。

3 結 論

本實驗研究微波輔助提取-水蒸氣蒸餾(MAE-SD)用于提取中藥花椒揮發油的方法，與傳統水蒸氣蒸餾提取法相比，該法可顯著提高提取效率，得到純凈的揮發油，揮發油的組分種類、理化性質與傳統水蒸氣蒸餾法接近，但在相對含量上有所差異。與已有文獻相比，本實驗所確定的方法提取效率高，所分離和鑒定的成分多，為花椒揮發油的開發利用提供了重要的基礎數據。MAE-SD 聯合GC-MS為揮發油類成分的快速提取和分析提供了一種有效的方法。

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Analysis of Volatile Oil Composition of Pricklyash Peel (Zanthoxylum bungeanum) by Microwave Assisted Steam Distillation Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

FANG Xin-sheng1，WANG Chao2，MA Wei-zhi1，LI Ming-hui1，WANG Jian-hua1,*，ZHANG Li1，XU Ning1
(1. State Key Laboratory of Crop Biology, College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China；2. College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

In the extraction of volatile oil from pricklyash peel by microwave-assisted steam distillation (MASD), main extraction parameters were optimized by orthogonal assay design based on extraction efficiency with the purpose of developing a sample preparation method for rapid analysis of volatile oil composition of pricklyash peel by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The effects of MASD and single steam distillation on the extraction efficiency, physicochemical properties and chemical composition of volatile oil from pricklyash peel were compared. The optimal MASD parameters were determined as follows: microwave power 400 W, extraction time 20 min, and the amount of water addition 15 mL/g. Totally, 137 compounds were separated in the GC-MS analysis of volatile oil extracted by MASD, and 59 of them had higher than 90% mass spectral similarities, including the dominant compounds sabinene (3.72%), beta-myrcene (8.34%), sylvestren (15.15%), terpinene(3.65%), cineole (6.25%), alpha-pinene (4.95%), beta.-linalool (3.05%), 4-carvomenthenol (10.48%), alpha-terpieol (3.55%)and alpha-terpineol acetate (4.09%), which were quantitatively determined by peak area normalization method. Volatile oils extracted by both methods had similar compound composition and physicochemical properties but differed in the relative contents of their common components. In summary, an efficient and effective extraction of volatile oil can be achieved by using MASD. Volatile oil composition can be rapidly analyzed by MASD coupled with GC-MS.

pricklyash peel (Zanthoxylum bungeanum)；volatile oil；microwave assisted extraction；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS207.3；R284.2

A

1002-6630(2011)08-0262-05

2010-06-25

山東農業大學SRT項目(SRT-0901015)

房信勝(1974—)，男，講師，碩士，研究方向為中藥質量控制與資源開發利用。E-mail：xinshf@126.com*通信作者：王建華(1965—)，男，教授，博士，研究方向為中藥資源與開發。E-mail：jhwangjh@163.com