氨基化聚苯乙烯微球的制備及在克倫特羅抗體純化中的應(yīng)用

趙書閣，劉麗強，彭池方，徐麗廣，胡擁明，徐萬仁，胥傳來*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

氨基化聚苯乙烯微球的制備及在克倫特羅抗體純化中的應(yīng)用

趙書閣，劉麗強，彭池方，徐麗廣，胡擁明，徐萬仁，胥傳來*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

進行氨基聚苯乙烯微球制備方法及其應(yīng)用于克倫特羅抗體純化的研究。通過分散聚合法制備聚苯乙烯微球，硝基反應(yīng)成硝基化聚苯乙烯微球，再還原成氨基化微球。并利用電子顯微鏡及紅外光譜儀對微球形態(tài)及結(jié)構(gòu)進行表征。成功制備氨基聚苯乙烯微球后，將微球與鹽酸克倫特羅分子發(fā)生重氮化反應(yīng)，得到連接克倫特羅分子的微球。將這種微球免疫親和吸附分離鹽酸克倫特羅的抗體。最后將純化后的抗體通過紫外檢測，電泳檢測等方法證明所制備的微球用于抗體的純化可行。

聚苯乙烯微球；鹽酸克倫特羅；抗體純化；免疫親和純化

高分子微球是直徑在納米級至微米級、形狀為球形或其他幾何體的高分子材料及高分子復(fù)合材料，包括實心微球、空心微球、多孔微球及一些各向異性微球。高分子微球的起源非常悠久，最早的高分子微球來自天然的橡膠樹的樹液，被稱為乳膠[1-6]。也許正是由于這個原因，合成的高分子微球最早被應(yīng)用于橡膠制品或橡膠制品的添加劑，這些高分子微球都是由具有彈性的聚合物組成，如聚丁二烯、聚異戊二烯等。隨著微球制備技術(shù)的發(fā)展，高分子微球又被應(yīng)用于涂料、紙張的表面加工、黏接劑、塑料添加物、建筑材料等一般工業(yè)領(lǐng)域[7-13]。近十幾年來，高分子微球制備技術(shù)逐步完善，建立了0.02～100μm的均一尺寸的制備方法，尤其是納米級微球(數(shù)納米)和超大微球的制備技術(shù)有了突破性的進展。高分子微球的制備及應(yīng)用己經(jīng)發(fā)展成材料學(xué)的一個重要研究方向[14-16]。聚苯乙烯微球作為一種高分子微球，因其特殊的形狀、大小及結(jié)構(gòu)，被應(yīng)用于許多重要領(lǐng)域。楊春洪等[17]利用碳化二亞胺法，將表面帶有羧基的聚丙烯酰胺固相微球作為載體，共價結(jié)合黃曲霉毒素抗體，對其最佳的偶聯(lián)條件進行了研究。賀銳等[18]制備了帶磺酸基的聚苯乙烯微球，并研究其對蛋白質(zhì)的吸附作用。本實驗用制備的氨基聚苯乙烯微球?qū)藗愄亓_抗體的純化效果進行研究，并與普通的飽和硫酸銨沉淀法的純化效果進行比較，采用傳統(tǒng)的ELISA方法對各自純化后的抗體進行檢測，旨在考察高分子聚合物微球純化抗體的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸克倫特羅、鹽酸克倫特羅抗體 自制；偶氮二異丁腈 華美生物工程公司；聚乙烯吡咯烷酮 北京拜爾迪生物技術(shù)公司；對羧基苯甲醛、N,N-二甲基苯胺 上海晶純試劑有限公司；乙腈 美國Fisher公司；乙二胺四乙酸 北京精益化工廠；聚丙烯酰胺 中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑總公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-40B臺式低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；1810-B石英自動雙重純水蒸餾器 金壇市榮華儀器制造有限公司；U-3000紫外掃描儀 日本島津公司；Platform ZMD 4000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Nexus 470傅里葉變換(原位)紅外光譜儀美國Thermo Nicolet公司；Nova NanoSEM x30超高分辨率場發(fā)射掃描電子顯微鏡 FEI香港有限公司；DYY-8C型瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 氨基聚苯乙烯微球(amino-polystyrene microspheres，PAS)的制備及鑒定

1.3.1.1 聚苯乙烯(polystyrene microsphere，PS)微球的合成

制備PS微球的配方見表1。將聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、無水乙醇和去離子水按配方加入反應(yīng)釜中，攪拌轉(zhuǎn)速130r/min，使其形成均相物系，并通氮氣鼓氣泡排空氣20min，然后開啟溫控系統(tǒng)，使物系迅速升溫到70℃，當(dāng)溫度穩(wěn)定后，加入定量的苯乙烯(styrene，St)和偶氮二異丁腈(azobisisobutyronitrile，AIBN)振蕩混合物，保持攪拌轉(zhuǎn)速不變，在氮氣氣氛中反應(yīng)12h后自然冷卻終止，得到白色乳液。將上述白色乳液以5000r/min的轉(zhuǎn)速進行離心沉降，除去上清液，加入無水乙醇經(jīng)超聲分散清洗下層微球，然后再離心沉降，洗滌，如此反復(fù)操作3遍。最后將洗滌后的微球37℃真空干燥24h，即得到白色粉末狀PS微球。

表1 制備PS微球的配方Table 1 Preparation formula for polystyrene (PS) microspheres

1.3.1.2 硝基聚苯乙烯微球(nitro polystyrene microspheres，PNS)的制備

燒瓶中加入1.0g聚苯乙烯微球，加入10mL去離子水，配制成10g/100mL的聚苯乙烯微球乳液。在50℃水浴中高速攪拌下，加入硫酸與硝酸比例為3:2的混合酸，反應(yīng)2h。將反應(yīng)混合物注入去離子水中，過濾，并用去離子水洗滌至濾除產(chǎn)物的pH值呈中性，將洗滌后的微球37℃真空干燥24h，得到淡黃色粉末。

1.3.1.3 PAS的制備

取0.5g硝基聚苯乙烯微球于燒瓶中，在75℃油浴中高速攪拌下，加入2mol/L KOH溶液30mL，加入2g還原劑Na2S2O4，反應(yīng)4h。將反應(yīng)混合物過濾，并用去離子水洗滌至濾除產(chǎn)物的pH值呈中性，將洗滌后的微球37℃真空干燥24h，得到黃色粉末。

1.3.1.4 產(chǎn)物的鑒定表征

用場發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡觀察微球形態(tài)，紅外光譜儀測定微球表面官能團性質(zhì)。

1.3.2 硫酸銨法純化克倫特羅的抗體

采用兩步沉淀法：①取等量的抗體血清(質(zhì)量濃度為10mg/mL)500μL和生理鹽水混勻，然后加入1mL飽和硫酸銨，混勻，4℃靜置1h；然后5000r/min離心20min，棄上清；②把沉淀用500μL生理鹽水混勻，再加入500μL飽和硫酸銨，混勻，4℃靜置1h后5000r/min離心20min，棄上清液；③把沉淀用500μL生理鹽水重懸，置0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中透析24h。最后得到純化后的抗體。

1.3.3 氨基PS微球偶聯(lián)克倫特羅(clenbuterol，CL)方法

1.3.3.1 克倫特羅重氮化

取0.2mmol的鹽酸克倫特羅，加入到2mL 1mol/L預(yù)冷的HCl溶液中，冰浴攪拌，慢慢滴加1mol/L的NaNO2，期間不斷用KI試紙檢測，直至試紙變?yōu)樯钭仙Ｖ沟渭樱^續(xù)攪拌30min。

1.3.3.2 氨基PS微球偶聯(lián)克倫特羅

取10mg的氨基PS微球，加入到制備的重氮化鹽酸克倫特羅中，避光反應(yīng)，室溫持續(xù)攪拌3h。透析3d除去多余的克倫特羅小分子，過濾，37℃真空干燥24h，得到淡黃色粉末狀固體，即為CL-PS(clenbuterolpolystyrene)微球。

1.3.4 CL-PS微球純化抗體方法

分別取所得到的不同量CL-PS微球0.5、1、2、5、7.5、10mg溶解在1mL的PBS中，均分別加入200μL克倫特羅抗體(質(zhì)量濃度為10mg/mL)，室溫條件下反應(yīng)1h，得到吸附克倫特羅抗體的微球。離心，棄去上清液，收集吸附克倫特羅抗體的微球，將微球置于1mL 70%甲醇中，振蕩反應(yīng)1h，離心，收集上清液，用超濾管離心，置換甲醇，重新溶解于200μL PBS中，得到純化后的克倫特羅抗體。

1.3.5 抗體純化的鑒定

1.3.5.1 紫外檢測

以波長(λ)為橫坐標(nm)，吸光度(A)為縱坐標作圖，即得到紫外光譜(ultra violet spectra，UV)。取純化后的抗體溶液100μL用PBS稀釋10倍后，在200～400nm波長范圍進行紫外掃描測定。

1.3.5.2 電泳檢測(SDS-PAGE鑒定法)[19]

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)鑒定法。

1.3.6 純化抗體的效價測定

采用間接ELISA[20]方法，方陣滴定法測定抗體的效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基PS微球的表征

2.1.1 SEM表征

分別將各樣品用場發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡進行觀察。圖1所示的是PS微球的SEM圖片，可以看出，PS微球具有良好的球形度并且單分散性好，這為PS微球的進一步硝基化和氨基化提供了可靠的保證。

圖1 表面無官能團的聚苯乙烯微球Fig.1 PS microspheres without surface functional groups

圖2 硝基聚苯乙烯微球Fig.2 PNS microspheres

圖3 氨基聚苯乙烯微球Fig.3 PAS microspheres

圖2 、3分別是PNS和PAS微球的SEM圖片，PS微球在經(jīng)過氧化性和腐蝕性極強的混合酸硝化之后，雖然保持了較好的球形度，但結(jié)構(gòu)和形態(tài)遭到破壞，分散性不是很好。此外強還原劑Na2S2O4對微球的結(jié)構(gòu)和形態(tài)產(chǎn)生一定的影響，PAS微球的球形度和分散性不是很好，微球形成條件仍需探索調(diào)整。

2.1.2 紅外光譜表征

圖4 氨基聚苯乙烯微球的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of PAS microspheres

采用KBr制樣法，設(shè)定分辨率4cm-1，掃描次數(shù)32次。從圖4中可以看出，1452cm-1和1492cm-1處為苯環(huán)C—C的伸縮振動峰，697cm-1和755cm-1為苯環(huán)上C—H鍵的同位相面外彎曲振動吸收峰，3025cm-1尖銳峰為烯烴上C—H伸縮振動峰，1540cm-1附近C＝C伸縮振動吸收。1028cm-1和905cm-1為乙烯基上C—H彎曲振動的重要特征。1679cm-1處為C＝O基的伸縮振動峰。3433cm-1為—NH2的反對稱伸縮振動峰。紅外光譜結(jié)果說明聚苯乙烯微球的氨基化是成功。

2.2 純化抗體的紫外鑒定

圖5中280nm處為鹽酸克倫特羅抗體的特征峰，在所用微球量由0.5mg逐漸增大到5mg時，純化得到的克倫特羅抗體量逐漸增大，但是再增加到7.5、10mg時，得到的抗體量不再變化，最大抗體吸光度A280nm約為0.3，硫酸銨沉淀法純化的抗體最大吸光度為0.41，因為抗體濃度是在稀釋10倍的條件下測定，因此純化后得到的最大抗體濃度分別是：微球法為3mg/mL，普通的硫酸銨沉淀法為4.1mg/mL，與抗體原質(zhì)量濃度10mg/mL相比，低了很多，說明在純化的過程中除去了很多雜蛋白。

圖5 鹽酸克倫特羅抗體的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of antibodies purified by sulphuric acid ammonium method or with different amounts of PS microspheres

2.3 純化抗體的效果

從圖6可看出，經(jīng)純化的抗體純度提高，雜質(zhì)較少，微球親和純化的抗體條帶較硫酸銨純化的抗體條帶稍窄，說明親和純化過程中，去除了一些非特異的IgG，而且在洗脫過程中，也可能存在抗體沒有完全洗脫，造成純化后的抗體濃度比傳統(tǒng)的硫酸銨法的稍低，與紫外圖的最大吸光度相符，說明微球法純化的抗體純度更高一些，但是得到的純化抗體量沒有硫酸銨法高。

圖6 鹽酸克倫特羅抗體的電泳圖Fig.6 Electrophotogram of anti-clenbuterol antibodies

2.4 純化抗體的效價測定

將微球純化法所得抗體與硫酸銨法純化所得抗體均配成1mg/mL，然后分別做間接ELISA實驗，測定結(jié)果分別見表2、3。

陽性血清的A450大于等于陰性對照孔的2.1倍并且A450大于0.1，此時的抗體稀釋倍數(shù)即是該抗血清的效價。由測定結(jié)果可知，兩種方法的抗體效價分別為硫酸銨法72900、微球純化法218700。微球純化法的效價相對較高，證明了微球純化的可行性與高效性。

3 結(jié) 論

本研究探索了聚苯乙烯微球、硝基化微球、氨基化微球的制備條件并對所得進行表征，初步確定了氨基聚苯乙烯微球制備方法。得到氨基聚苯乙烯微球后，與克倫特羅分子發(fā)生重氮化反應(yīng)，將克倫特羅分子成功連接在微球上。所得微球與鹽酸克倫特羅抗體進行親和純化。最后進行了表征，通過紫外檢測，電泳檢測等方法證明所制備的微球可以用于抗體的純化。并用純化的抗體做克倫特羅的ELISA檢測，并與硫酸銨法純化所得抗體相互比較，證明了微球純化的可行性及高效性。

表2 硫酸銨法純化抗體的效價及其作用濃度Table 2 Titer and working concentration of antibody purified by sulphuric acid ammonium method

表3 微球純化抗體的效價及其作用濃度Table 3 Titer and working concentration of antibody purified by this method

[1] 胡忠良, 馬承銀, 黃可龍, 等. 無皂乳液聚合的理論研究及其制備方法[J]. 安徽化工, 2001, 112(4): 46-48.

[2] 錢曉峰, 陳濤, 郭商勇. 準分子激光加工PMMA生物芯片片基的實驗研究[J]. 微納電子技術(shù), 2006, 43(1): 47-49.

[3] 楊旭, 李欣. 懸浮聚合法制備穩(wěn)定的多孔高分子微球[J]. 材料導(dǎo)報,2007(2): 146-147.

[4] 汪靜, 李康, 錢衛(wèi)平, 等. 垂直沉積法制備二氧化硅膠體晶體及其表征[J]. 東南大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2003, 33(2): 208-210.

[5] 張洪濤, 呂睿, 陳敏. 分散共聚合制備PSt-AA-EGDMA功能性單分散微米級交聯(lián)微球的研究[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報, 2004, 25(2): 366-371.

[6] 張凱, 雷毅, 王宇光, 等. 微米級單分散共聚物微球的制備[J]. 高分子學(xué)報, 2002(3): 341-344.

[7] 黃錦霞, 許俊鴻, 孫蓉, 等. 苯乙烯/二乙烯基苯在乙醇/乙二醇單甲醚中分散共聚合速率及粒子大小的研究[J]. 高分子學(xué)報, 2003(4):535-539.

[8] 由英才, 祁東風(fēng), 張保龍, 等. 種子聚合法制備單分散交聯(lián)聚苯乙烯微球的研究[J]. 高分子材料科學(xué)與工程, 1994(6): 13-17.

[9] 羅正平, 張秋禹, 謝鋼, 等. 分散聚合研究[J]. 高分子通報, 2002(5):35-40.

[10] 曹同玉, 戴兵, 戴俊燕. 單分散大粒徑聚合物微球的合成及應(yīng)用[J].高分子通報, 1995(3): 174-180.

[11] MASCHER D G, UNGER C P, MASCHER H J. Determination of neomycin and bacitracin in human or rabbit serum by HPLC-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 43(2):691-700.

[12] van BRUIJNSVOORT M, OTTINK S J M, JONKER K M, et al.Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in milk and honey by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography A, 2004, 1058(1/2): 137-142.

[13] FLURER C L. The analysis of aminoglycoside antibiotics by capillary electrophoresis[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,1995, 13(7): 809-816.

[14] HAASNOOT W, STOUTEN P, CAZEMIER G, et al. Immunochemical detection of aminoglycosides in milk and kidney [J]. The Analyst,1999, 124(3): 301-305.

[15] LOOMANS E E, van WILTENBURG J, van AMERONGEN A, et al.Neamin as immunogen for the development of a generic ELISA detecting gentamicin, kanamycin and neomycin in milk[J]. J Agric Food Chem,2003, 51(3): 587-593.

[16] 朱立平, 陳學(xué)清. 免疫學(xué)常用實驗方法[M]. 北京: 人民軍醫(yī)出版社,2000: 52-81.

[17] 楊春洪, 李培武, 劉學(xué)群. 聚丙烯酰胺固相微球與黃曲霉毒素B1抗體偶聯(lián)條件的研究[J]. 中國油料作物學(xué)報, 2005, 27(2): 62-65.

[18] 賀銳, 曹光群, 楊吉. 表面帶磺酸基團的聚苯乙烯微球的制備及其對蛋白質(zhì)的吸附[J]. 化工進展, 2007, 26(7): 991-994.

[19] 何忠效, 張樹政. 電泳[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999: 11-45.

[20] FENG Weiyun, ZHAO Luhang, WANG Keyi, et al. Interaction of polysaccharides with interferon-gamma using an improved ELISA approach[J].Carbohydrate Polymers, 2004, 58(1): 89-94.

Preparation of Amino-polystyrene Microspheres and Its Application in Purification of Antibodies against Clenbuterol

ZHAO Shu-ge，LIU Li-qiang，PENG Chi-fang，XU Li-guang，HU Yong-ming，XU Wan-ren，XU Chuan-lai*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The objectives of this study were to develop a preparation method for amino-polystyrene microspheres and to evaluate its application in purification of antibodies against clenbuterol. Polystyrene was prepared by dispersion polymerization,and converted into polystyrene microspheres by nitration reaction, which were reduced into amino-microspheres. Scanning electron microscopy and infrared spectrometry was used to characterize the shape and structure of microspheres. Aminopolystyrene microspheres were bound with clenbuterol molecules by diazotization reaction. Amino-polystyrene microspheres with clenbuterol were applied in the immunoaffinity adsorption and separation of anti-clenbuterol antibodies. Finally, purified antibodies were detected by UV and electrophoresis assay. We proved that it is feasible to use amino-polystyrene microspheres with clenbuterol prepared in this study to purify anti-clenbuterol antibodies.

polystyrene；clenbuterol；antibody purification；immunoaffinity

TQ316.3；S859.84

B

1002-6630(2011)08-0318-05

2010-07-17

趙書閣(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為殘留物檢測。E-mail：shugezhao@126.com

*通信作者：胥傳來(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn