丁香揮發油的體外抗氧化作用研究

鄭州拓洋實業有限公司 蘇筱渲 徐 琳 吳 娜

丁香揮發油的體外抗氧化作用研究

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丁香為桃金娘科植物丁香（Eugenia caryophyllata Thun.）的干燥花蕾，是藥食兩用植物。丁香中主要含有有機酸類、苷類、揮發油類、黃酮類等有效成分，具有廣泛的生理活性。經研究丁香揮發油的主要成分有丁香酚、石竹烯、異丁香酚、檀香醇等具有抗氧化活性成分。近年來，隨著對傳統合成抗氧化劑BHT，BHA，TBHQ等毒性問題的提出，天然抗氧化劑越來越受到食品飼料等行業的青睞，特別是植物源抗氧化劑，因其具有來源廣泛、提取率高、抗氧化性強、與機體親和力強和安全性高等優點，使天然抗氧化劑的研究逐漸成為熱點。本文，筆者旨在討論丁香揮發油的抗氧化作用及其機制，為開發丁香揮發油提供參考和依據。

一、材料與儀器

采用在藥材市場購買的丁香干花蕾。實驗動物為昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，體重（20±2）g，由河南省疾控中心提供。魯米諾，色譜純，Sigma公司產品；MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其他均為國產分析純試劑。

分析天平（AE240），梅特勒公司；旋轉蒸發儀，中國鞏義予華；化學發光儀（PHOTOCHEM），德國耶拿公司；超臨界萃取裝置（1L），中國南通華安公司。

二、實驗方法

1.丁香揮發油的制備。超臨界萃取裝置CO2流量控制在15kg/h，每次進樣量500g，在30MPa，45℃的條件下，萃取120min，所提取揮發油用乙醚溶解，加無水硫酸鈉干燥，過濾，用旋轉蒸發器除去乙醚，得淡黃色透明液體。

2.化學發光測量條件。采用BPCL型超微弱化學發光測量儀(中國科學院生物物理所)進行測定，測試條件：Hi-V800；Kv-1；記錄的波長范圍：180~800nm；溫度：30℃。

3.丁香揮發油對超氧陰離子的清除作用檢測方法。采用鄰苯三酚一魯米諾化學發光體系。試劑配制方法：魯米諾用0.05mol/L的NaOH溶液配成lmmol/L的溶液；鄰苯三酚用lmmol/L HCL配成6.25×10。mol/L溶液；0.05mol/L pH10.2的Na2CO3·NaHCO3緩沖液（含0.1mmol/L EDTA）與1mmol/L魯米諾以2∶1（v∶v）混合成魯米諾和碳酸鹽緩沖液混合物。測定方法：向發光池中加入樣品溶液（空白對照為無水乙醇，樣品溶液用無水乙醇配制）10μL，6.25×10mol／L鄰苯三酚50μL，魯米諾和碳酸鹽緩沖液混合物940μL啟動反應，間隔2s記數發光強度，測定300s的發光強度，本底發光強度為不加鄰苯三酚時的發光值。

4.丁香揮發油對羥基自由基的清除作用檢測方法。采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2化學發光體系，向發光池中加入樣品溶液（以無水乙醇為對照）50μL，1.0mmol/L CuSO4溶液50μL，1mmol/L鄰菲啉溶液50μL，和0.05mol/L硼砂溶液700μL（pH9.0），1mmol/L抗壞血酸溶液100μL和0.15%H2O2溶液50μL，立即啟動化學發光系統，間隔3s記數，記錄400s內化學發光動力學曲線，本底不加雙氧水。

5.丁香揮發油對H2O2的清除作用檢測方法。采用雙氧水-魯米諾化學發光體系，向發光池中加入樣品溶液（以無水乙醇為對照）50μL，0.15mol/L H2O250μL和0.1mmol/L魯米諾-0.05mol/L pH9.4碳酸鹽緩沖液混合液（體積比為1∶17）900μL，啟動發光系統，間隔3s記數，記錄120s內發光強度，本底不加雙氧水。

6.丁香揮發油對體外小鼠肝勻漿生成MDA的測定方法。參照黃曉蘭，閻俊，吳曉文，等的研究，制備10%肝組織勻漿液。每支試管加10%小鼠肝勻漿0.2m l，給藥組每管分別加濃度為0.05、0.5、2.0、10.0g/L的揮發油0.1mL，對照組加等體積生理鹽水，再分別加誘導試液FeSO4（1mmolL）0.1mL、H2O2（1mmolL）0.1mL，37℃溫育1h（對照以等體積無水乙醇代替樣品溶液），置冰水中冷卻，再按MDA試劑盒方法操作，測定A532并計算MDA含量（nmol/mg.pr）。

7.數據處理方法。以抑制O-2·和·OH的發光強度一半的濃度（IC50）為標準，判斷丁香揮發油的有效性和效價；實驗數據表示為方差分析進行統計學處理。

三、結果與討論

1.丁香揮發油和VC對超氧陰離子自由基的清除作用。本體系中鄰苯三酚在堿性條件下氧化產生超氧陰離子，以魯米諾為發光劑，超氧陰離子激發魯米諾，魯米諾由激發態返回到基態時產生化學發光。抗氧化劑的加入可清除超氧陰離子，從而抑制化學發光。丁香揮發油的有效半數清除濃度（IC50）為175.73mg/L，與260.42mg/L的VC的清除能力相當，而且丁香揮發油對體系中產生的O-2·的抑制率與丁香揮發油的濃度呈正比例關系。丁香揮發油能有效清除超氧陰離子。如表1、圖1所示。

圖1 不同濃度的丁香揮發油抑制超氧陰離子的化學發光動力學曲線

2.丁香揮發油和VC對·OH的清除作用。本體系中，Cu2+被Vc還原成Cu+，Cu+與H2O2在Fenton反應中產生·OH，·OH氧化鄰菲啉（Phen），使Phen激發，Phen退激時產生化學發光。抗氧化劑的加入可清除·OH，降低化學發光強度。丁香揮發油對·OH的清除率隨著濃度的增加而增大，量效關系非常明顯。丁香揮發油的IC50為28.39mg/L，與13.81mg/L的VC清除能力相當。見表2。羥基自由基是已知的最強的氧化劑，具有極強的反應性，壽命極短，在很多緩沖溶液中，只要一產生，就會同緩沖溶液反應。它幾乎可以攻擊所有的鄰近細胞，同細胞中的所有成分發生反應，對人體的危害最大。該試驗結果表明丁香揮發油中含有抗氧化劑，能抑制羥基自由基的氧化。如圖2所示。

表2 丁香揮發油和VC清除羥基自由基

圖2 不同濃度丁香揮發油清除羥基自由基化學發光動力學曲線

3.丁香揮發油和VC對H2O2的清除作用。本體系中，H2O2能在有O2和堿性條件下氧化魯米諾產生化學發光。加入一定量的抗氧化劑，清除H2O2，可抑制化學發光。丁香揮發油的IC50為0.24mg/L，VC的IC500.36mg/L，丁香揮發油的清除能力強于VC。見表3。表明丁香揮發油的加入，使發光峰值下降；隨濃度的增大，發光更弱。如圖3所示。

表3 丁香揮發油和VC清除H2O2

圖3 不同濃度丁香揮發油清除H202化學發光動力學曲線圖

4.丁香揮發油對體外小鼠肝勻漿生成MDA的影響。與對照組相比較，在實驗濃度范圍內對自氧化、Fe2+誘導和H2O2誘導3種體系中的小鼠肝勻漿MDA的生成均有極顯著的抑制效果，并呈劑量—效應關系。10mg/L丁香揮發油對H2O2誘導的MDA生成抑制率高達74.12%（表4）。說明丁香揮發油對小鼠肝組織自發性脂質過氧化和誘導脂質過氧化均有較強的抑制作用。

表4 丁香揮發油對Fe2+和H2O2誘導小鼠肝勻漿生成MDA（n=10，x±s）

四、結論

自由基學說認為自由基能使細胞受到損害，很多疾病如老年癡呆癥、帕金森癥、肌萎縮性側索硬化癥，還有癌癥等的發生都與自由基有關。本實驗采用體外產生活性氧自由基系統，通過對活性氧自由基的清除作用證實丁香揮發油是一種有效的自由基清除劑，對羥基自由基的清除作用更強。丁香揮發油可以抑制小鼠肝的脂質過氧化，從而維持生物膜的完整性，防止生物膜的氧化損傷。丁香資源豐富，尚未得到有效的利用。近年來，有關丁香有效成分和藥理作用的研究已經引起一定的關注，本研究的結果為促進丁香資源進一步開發利用提供實驗資料。